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Biology

लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस लार संग्रह के लिए दो स्तरित झिल्ली सैंडविच विधि

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल कृत्रिम माध्यम का उपयोग करके भेदी-चूसने वाली कीड़ों से पर्याप्त लार एकत्र करने की विधि का वर्णन करता है। यह कीट लार इकट्ठा करने और कीट खिला व्यवहार और वेक्टर जनित वायरस संचरण पर लार समारोह का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका है।

Abstract

चावल धारी वायरस (आरएसवी), जो पूर्वी एशिया में कृषि के महत्वपूर्ण आर्थिक नुकसान का कारण बनता है, पूरी तरह से मेजबान चावल के बीच अपने प्रभावी संचरण के लिए कीट वैक्टर पर निर्भर करता है । लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस (छोटे भूरे रंग के प्लांटहॉपर, एसबीपीएच) प्राथमिक कीट वेक्टर है जो क्षैतिज रूप से आरएसवी को पहुंचाता है जबकि फ्लोएम से रस चूसने के दौरान। लार कीड़ों के खिलाने के व्यवहार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एक सुविधाजनक विधि जो भेदी-चूसने वाले भोजन व्यवहार के साथ कीड़ों की लार पर शोध के लिए उपयोगी होगी, यहां वर्णित है। इस विधि में, कीड़ों को दो फैला पैराफिन फिल्म परतों के बीच सैंडविच किए गए कृत्रिम आहार पर खिलाने की अनुमति दी गई थी। लार युक्त आहार प्रत्येक दिन एकत्र किया गया था, फ़िल्टर किया गया था, और आगे के विश्लेषण के लिए केंद्रित था। अंत में, एकत्र लार की गुणवत्ता प्रोटीन धुंधला और इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा जांच की गई। एसबीपीएच की लार में आरएसवी की उपस्थिति और म्यूसिन जैसे प्रोटीन का पता लगाकर इस विधि का उदाहरण दिया गया। ये कृत्रिम भोजन और लार संग्रह विधि भोजन व्यवहार और वायरस संचरण से संबंधित कीट लार में कारकों पर आगे अनुसंधान के लिए एक नींव रखेंगे ।

Introduction

टेनुइवायरसजीनस में नकारात्मक रूप से फंसे आरएनए वायरस चावल धारी वायरस (आरएसवी)पूर्वी एशिया1,2,3में चावल उत्पादन में गंभीर बीमारियों का कारण बनता है । संक्रमित चावल के पौधों से स्वस्थ लोगों के लिए आरएसवी का संचरण कीट वैक्टर पर निर्भर करता है, मुख्य रूप से लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस, जो लगातार प्रचारात्मक तरीके से आरएसवी को पहुंचाता है। एसबीपीएच आरएसवी-संक्रमित पौधों पर भोजन करने के बाद वायरस प्राप्त करता है। एक बार कीट के अंदर, आरएसवी खिलाने के एक दिन बाद मिडगुट एपिथेलियल सेल को संक्रमित करता है और फिर हीमोलिम्फ में प्रवेश करने के लिए मिडगुट बैरियर से गुजरता है। इसके बाद, आरएसवी हीमोलिम्फ के माध्यम से विभिन्न ऊतकों में फैलता है और फिर प्रचारित करता है। अधिग्रहण के बाद लगभग 10-14 दिनों की अव्यक्त अवधि के बाद, लार ग्रंथि के अंदर वायरस को स्रावित लार के माध्यम से स्वस्थ मेजबान पौधों में प्रेषित किया जा सकता है जबकिएसबीपीएच फ्लोएम4,5,6,7,8,9,10 से रस बेकार करता है . कीट से मेजबान पौधे तक आरएसवी के प्रसार के लिए एक कुशल भोजन प्रक्रिया और लार में विभिन्न कारक आवश्यक हैं।

लार ग्रंथियों द्वारा स्रावित कीट लार को कीड़े, वायरस और मेजबान पौधों में मध्यस्थता करने के लिए माना जाता है। हेमीप्टरन कीट आमतौर पर दो प्रकार की लार उत्पन्न करते हैं: लार और पानी की लार11,12,13. गेलिंग लार मुख्य रूप से मेजबान कोशिकाओं के बीच स्टाइल के आंदोलन को बनाए रखने के लिए एपोप्लाज्म में स्रावित होती है और इसका संबंध पौधों के प्रतिरोध और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर काबू पाने से भी है14,15,16,17. भोजन के जांच चरण में, कीड़े रुक-रुककर जेलिंग लार को स्रावित करते हैं जो तुरंत सतह फ्लैंज बनाने के लिए ऑक्सीकरण हो जाता है। फिर, एकल या शाखादार म्यान एक ट्यूबलर चैनल 18,19,20आरक्षित करने के लिए स्टाइल को संलग्नकरतेहैं। एपिडर्मिस पर सतह फ्लैंज को एक लंगर बिंदु के रूप में सेवा करके स्टाइल के प्रवेश को सुविधाजनक माना जाता है, जबकि स्टाइल के चारों ओर म्यान यांत्रिक स्थिरता और स्नेहन16, 21,22,23प्रदान कर सकता है। एनएलएसएचपी को लार म्यान गठन और भूरे रंग के प्लांटहॉपर(निलापरवता लुगेन्स,बीपीएच) के सफल भोजन के लिए एक आवश्यक प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था। एफिड एसिर्थोस्फोन पिसम द्वारा स्रावित संरचनात्मक म्यान प्रोटीन (एसएचपी) की अभिव्यक्ति के अवरोध ने मेजबान छलनीट्यूबों 24से भोजन में बाधा डालकर अपने प्रजनन को कम कर दिया । इसके अलावा, कुछ कीट प्रजातियों में, जेल लार कारकों को तथाकथित शाकाहारी से जुड़े आणविक पैटर्न (HAMPs) बनाकर पौधों की प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए माना जाता है। एन लुगेन्स,एनएलएमएलपी में, म्यान गठन से संबंधित एक म्यूसिन जैसे प्रोटीन, सेल मृत्यु, रक्षा से संबंधित जीन की अभिव्यक्ति, और कैलोस बयान 25,26सहित खिलाने के खिलाफ पौधे की सुरक्षा प्रेरित करता है। इसके अलावा, एफिड्स में कुछ जेल लार कारकों को रोगजनक से जुड़े आणविक पैटर्न12, 15, 27के समान जीन-टू-जीन इंटरैक्शन के माध्यम से संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाओं को ट्रिगर करने के लिए साबित किया गया है।

कीट आहार और/या रोगजनक संचरण के लिए आवश्यक लार कारकों का अध्ययन करने के लिए, स्रावित लार का विश्लेषण करना आवश्यक है । यहां, लार की पर्याप्त मात्रा प्राप्त करने के लिए कृत्रिम भोजन और संग्रह विधियों को आगे के विश्लेषण के लिए वर्णित किया गया है। केवल एक ही पोषण तत्व युक्त माध्यम का उपयोग करके, कई लार प्रोटीन एकत्र किए गए और चांदी के धुंधला और पश्चिमी दाग द्वारा विश्लेषण किया गया। यह विधि लार में कारकों पर आगे अनुसंधान में सहायक होगी जो एसबीपीएच द्वारा आरएसवी संचरण के लिए आवश्यक हैं।

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Protocol

1. एसबीपीएच रखरखाव

  1. प्रयोगशाला में प्रति ग्लास चैंबर 5-6 चावल(ओरिज़ा सतिवा सीवी निप्पोंबाड़े) रोपण के साथ एक ग्लास इनक्यूबेटर (65 x 200 मिमी) में वीरुलीफेरस और आरएसवी-मुक्त एसबीपीएच व्यक्तियों को पीछे करें। चावल के पौधों को 16 घंटे की रोशनी/8 एच डार्क फोटोपीरियोड के तहत 25 डिग्री सेल्सियस पर उगाएं ।
    नोट: उग्र और आरएसवी मुक्त SBPH व्यक्तियों को शुरू में जियांग्सू प्रांत, चीन में पकड़ा गया ।
  2. आरएसवी रिबोन्यूक्लियोप्रोटीन (आरएनपी) के खिलाफ उठाए गए खरगोश आरएसवी-विशिष्ट पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ डॉट-एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसोर्बेंट परख (डॉट-एलिसा) द्वारा एसबीपी में आरएसवी का पता लगाएं।
    नोट: उच्च संतान संक्रमण दक्षता सुनिश्चित करने के लिए, उग्र महिलाओं को अलग से बनाए रखा गया था, और उनकी संतानों का 15% आरएसवी संक्रमण के लिए बेतरतीब ढंग से परीक्षण किया गया था। डॉट-एलिसा का विवरण चरण 1.3-1.7 में वर्णित है।
  3. कोटिंग बफर (0.05 एम एनए 2 सीओ 3 -नाएचसीओ3,पीएच 9.5) के20माइक्रोल में एकल एसबीपीएच को समरूप बनाएं। नायलॉन झिल्ली (सामग्रीकी तालिका देखें) पर प्रत्येक के 3 माइक्रोन स्पॉट करें, और फिर कमरे के तापमान (आरटी) पर झिल्ली को सुखा लें।
  4. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए अवरुद्ध बफर (पीबीएस + 3% स्किम दूध) के 15 मिलीएल के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  5. आर टी में 1 एच के लिए पीबीएस के 15 एमएल में आरएसवी (1:10000) के खिलाफ पतला प्राथमिक खरगोश-एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और हर बार 5 मिनट इनक्यूबेशन के लिए पीबीएस के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं।
  6. पीबीएस के 15 एमएल में सहिजन पेरोक्सिडास-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी (सामग्री की तालिकादेखें) के 1.5 माइक्रोन के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और हर बार 5 मिनट इनक्यूबेशन पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  7. निर्माता द्वारा प्रदान किए गए प्रोटोकॉल के अनुसार उन्नत एचआरपी-डीएबी क्रोमोजेनिक किट (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ इम्यूनोब्लॉट विकसित करें।

2. भोजन कक्ष और कृत्रिम आहार की तैयारी

  1. सुक्रोज पाउडर के 2 ग्राम वजन और कृत्रिम आहार के रूप में 5% सुक्रोज जलीय समाधान तैयार करने के लिए डीडीएच2ओ के 40 मिलील में इसे भंग करें।
  2. बैक्टीरियल संदूषण और अशुद्धियों को दूर करने के लिए 0.22 माइक्रोन फ़िल्टर (सामग्री की तालिकादेखें) के माध्यम से समाधान को फ़िल्टर करें।
  3. उन्हें कक्ष में शुरूकरने से पहले3-5 घंटे के लिए 200 3 -5 एसबीपीएच लार्वा भूखा।
    नोट: २०० SBPH एक कक्ष के लिए तैयार कर रहे हैं; अधिक SBPH कई कक्षों के लिए तैयार किया जाना चाहिए।
  4. ग्लास सिलेंडरों को फीडिंग चैम्बर्स(चित्रा 1A) केरूप में तैयार करें। प्रयोगात्मक कीड़ों को पेश करने से पहले एक पैराफिन झिल्ली (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ कक्ष के एक खुले छोर को कवर करें।
    नोट: प्रत्येक सिलेंडर 15.0 सेमी लंबा और व्यास में 2.5 सेमी है। ये कांच सिलेंडर प्रायोगिक आवश्यकता के अनुसार कस्टम-मेड होते हैं।
  5. कीड़ों को कांच के सिलेंडर में स्थानांतरित करें।
  6. कक्ष के दूसरे छोर को फैला हुआ पैराफिन झिल्ली (विशेष रूप से, पैराफिल्म एम) के साथ कवर करें। इसके बाद इसमें 200 माइक्रोन आर्टिफिशल डाइट डालें। अंत में, फैला पैराफिन झिल्ली की एक और परत के साथ तरल को कवर करें।
    नोट: पैराफिन झिल्ली के बारे में अपने मूल क्षेत्र दोगुनी करने के लिए फैला है ।
  7. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कक्ष को कवर करें, लेकिन प्रकाश के संपर्क में आने वाले कृत्रिम आहार डिवाइस के साथ अंत छोड़ दें।

3. एसबीपीएच लार का संग्रह

  1. 24 घंटे की अवधि के अंत में आरएसवी-मुक्त और उग्र स्वैबएच से अलग से कृत्रिम आहार लें।
  2. कीड़ों को स्थिर करने के लिए सिलेंडर को 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा करें।
  3. बाहरी फिल्म को उजागर करें और 1.5 एमएल बाँझ ट्यूबों में बाँझ पिपेट का उपयोग करके कृत्रिम आहार तरल एकत्र करें। एकत्र लार को विश्लेषण तक -80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: एकत्र लार 1 वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. धीरे-धीरे पाइपिंग करके तीन बार ताजा कृत्रिम आहार के 50 माइक्रोन के साथ आंतरिक झिल्ली को कुल्लाएं, और चरण 3.3 में वर्णित कृत्रिम वाशिंग आहार एकत्र करें। नए कृत्रिम आहार को भीतर की झिल्ली पर रखें और एक ताजा फैला पैराफिन झिल्ली शीर्ष पर रखें।
  5. 5 दिनों से 2 सप्ताह के लिए चरण 3.2 और 3.3 दोहराएं।
    नोट: कृत्रिम भोजन SBPH के जीवित रहने की दर की गणना करें और जीवित रहने की दर के अनुसार ताजा एसबीपीएच के पर्याप्त पूरक को सुनिश्चित करें।
  6. रोगाणुओं और अन्य प्रदूषकों को हटाने के लिए 0.22 माइक्रोन फिल्टर यूनिट के माध्यम से एकत्र किए गए नमूनों को फ़िल्टर करें।

4. एकत्र लार की एकाग्रता

  1. एकत्र किए गए लार के नमूनों को 0.5 एमएल 10 केडी सेंट्रलफ्यूगल फिल्टर (सामग्री की तालिकादेखें) में स्थानांतरित करें और 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,500 x ग्राम पर स्पिन करें। सुपरनेट को इकट्ठा करें और अंतिम वॉल्यूम को 100 माइक्रोल करें।
  2. 4.3-4.6 चरणों के बाद एक उपयुक्त यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके एकत्र लार की एकाग्रता को मापें।
  3. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर चालू करें और डीएच2ओ के साथ तीन बार आसन धोएं।
  4. स्क्रीन पर निम्नलिखित विकल्पों का चयन उचित क्रम में करें: प्रोटीन | प्रोटीन A280 | टाइप | चुनें 1 एब्स = 1 मिलीग्राम/एमएल। इसके बाद चेकबॉक्स बेसलाइन करेक्शन 340 एनएमचेक करें।
  5. खाली के रूप में 5% सुक्रोज जलीय समाधान के 2 माइक्रोन लोड करें, स्क्रीन के नीचे खाली स्पर्श करें।
  6. मानक निर्धारित करने के बाद, माप के लिए एकत्र लार के 2 माइक्रोन लोड करें। प्रोटीन एकाग्रता को पढ़ें और रिकॉर्ड करें।
    नोट: लार प्रोटीन के 1 मिलीग्राम अंत में कुल में एकत्र किए गए थे ।

5. लार प्रोटीन की चांदी धुंधला

  1. नमूना लोडिंग बफर (50 m Tris-HCl पीएच 6.8, 10% ग्लाइसरोल, 2% एसडीएस, 0.1% ब्रोमोफेनॉल ब्लू, और 1% β-मर्केप्टोथेनॉल) का उपयोग करके कीट लार के नमूनों से प्रोटीन निकालें। फिर, इसे 10% SDS-पेज (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा आंशिक करें। एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक ही तरीके से इलाज 5% सुक्रोजेकस समाधान लोड करें।
  2. एक पूर्व दाग मार्कर के साथ एक एसडीएस-पेज जेल पर नमूने का 20 μL aliquot लोड करें। 90 वोल्ट पर 15 मिनट के लिए जेल चलाएं, और फिर 140 वोल्ट पर 50 मिनट।
  3. इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद कम से कम 30 मिनट के लिए 30% (vol/vol) इथेनॉल, 10% (vol/vol) एसिटिक एसिड में जेल को ठीक करें।
  4. जेल को 20% (vol/vol) इथेनॉल और पानी के साथ दो बार 10 मिनट के लिए अलग से हर बार कुल्ला ।
  5. 1 मिनट के लिए 0.8 m सोडियम थिओसल्फेट में जेल को जागरूक करें, और फिर हर बार 1 मिनट के लिए पानी में दो बार कुल्ला करें।
  6. कम से कम 1 घंटे के लिए 12 mm चांदी नाइट्रेट में जेल विसर्जित करें, और फिर इसे डेवलपर समाधान में स्थानांतरित करने से पहले 10 एस के लिए डिपोनाइज्ड पानी में डुबोएं।
  7. जब जेल की पृष्ठभूमि अंधेरा हो रही है, तो प्रतिक्रिया को रोकने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए जेल को स्टॉप सॉल्यूशन (5% एसिटिक एसिड) में विसर्जित करें।
  8. जेल को हर बार 30 मिनट के लिए पानी से दो बार धोएं। डिटेक्शन सिस्टम के साथ छवि विकसित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।

6. पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा प्रोटीन का पता लगाना

  1. विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी दाग द्वारा क्रमशः एसबीपीएच (एलएसजीएमपी) और आरएसवी के लार म्यूसिन जैसे प्रोटीन का पता लगाएं।
  2. चरण 5.1 के बाद कीट लार के नमूनों का इलाज करें।
  3. एक 10% एसडीएस-पेज जेल पर नमूने का 20 माइक्रोन एलिकोट लोड करें और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में 20 माइक्रोन आरएसवी गैर-संक्रमित लार नमूना। 90 वोल्ट पर 15 मिनट के लिए जेल चलाएं, और फिर 140 वोल्ट पर 50 मिनट के लिए।
  4. 10x प्रोटीन ट्रांसफर बफर (गीला) (सामग्री की तालिकादेखें) के 100 एमएल को डीडीएच 2 ओ के 900 एमएल के साथ एक वर्क सॉल्यूशन(1x)में मिलाएं, और फिर प्रोटीन ट्रांसफर बफर (1x) का उपयोग करके एक पॉलीविनियडीन डिफ्लोराइड झिल्ली में प्रोटीन स्थानांतरित करें।
  5. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर 0.05% ट्वीन 20 (टीबीएसटी) के साथ 0.01 मीटर ट्रिस-बफर नमकीन के साथ 5% स्किम दूध में झिल्ली को ब्लॉक करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, 10x टीबीएसटी के 100 एमएल (सामग्री की तालिकादेखें) को डीडीएच2ओ के 900 एमएल के साथ कार्य समाधान में मिलाएं।
  6. आरएसवी या एलएसजीएमपी (दोनों 1:10000) के खिलाफ प्राथमिक खरगोश एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को कम से कम 2 घंटे के लिए आरटी में टीबीएसटी में पतला करें।
    नोट: आरएसवी के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी के उत्पादन का उल्लेख ऊपर किया गया था। एक जैव प्रौद्योगिकी कंपनी ने एलएसएसजीपी पेप्टाइड GIQFDSYSSSDLTRC के खिलाफ खरगोश विरोधी LssgMP पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उत्पादन किया।
  7. हर बार 10 मिनट इनक्यूबेशन के लिए टीबीटीटी के साथ झिल्ली को तीन बार धोएं।
  8. 1:10000 टीबीटी में पतला सहिजन पेरोक्सिडास-संयुग्मित बकरी विरोधी खरगोश एंटीबॉडी के साथ झिल्ली को इनक्यूबेट करें।
  9. बढ़ी हुई केमिल्यूमिनेसेंस वेस्टर्न ब्लॉटिंग डिटेक्शन सिस्टम के साथ इम्यूनोब्लॉट्स विकसित करें।

7. एसबीपीएच में एलएसजीएमपी अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाना

  1. कीड़ों को 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर करें।
  2. कीड़ों को 75% इथेनॉल और डीडीएच2ओ के साथ एक-एक करके धोएं, और फिर कीड़ों को पूर्व-ठंडा टीबीएस (0.01 एम ट्राइस-बफर खारा) में विच्छेदन करें।
  3. कोक्सा-ट्रोचंटर संयुक्त पर एसबीपीएच के अग्रभाग को संदंश द्वारा तोड़ते समय पेट से कीड़ों को विच्छेदन करें; हीमोलिम्फ से किसी भी संदूषण को दूर करने के लिए टीबीएस में दो बार मिडगुट और लार ग्रंथियों को धोएं।
  4. आरएनए निकालने के लिए 1.5 एमएल आरएनएसई-फ्री ट्यूब में पांच ऊतकों को रखें। प्रत्येक ट्यूब को एक नमूने के रूप में विचार करें।
  5. निर्माता के प्रोटोकॉल और रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शनल पीसीआर (आरटी-पीसीआर) (सामग्री की तालिकादेखें) के अनुसार आरएनए निष्कर्षण करें।
  6. पूरे शरीर या एल स्ट्राटेलसके विभिन्न ऊतकों के अर्क में LssgMP के सापेक्ष प्रतिलिपि अभिव्यक्ति के स्तर की जांच करने के लिए मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (क्यूआरटी-पीसीआर) करें।
    नोट: जीन प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले प्राइमर जोड़े एलएसजीएमपी-क्यू-एफ/एलएसएसजीएमपी-क्यू-आर, एसवाईबीआर ग्रीन-आधारित क्यूपीसीआर निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किए गए थे । सीडीएनए टेम्पलेट्स के सामान्यीकरण के लिए एल स्ट्राटेलस ट्रांसलेशन विस्तार कारक 2 (ef2)के ट्रांसक्रिप्ट स्तर को प्राइमर जोड़ी ef2-q-F/ef2-q-R के साथ निर्धारित किया गया था । और प्राइमर दृश्यों नीचे संलग्न हैं:LssgMP-क्यू-एफ:TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R:GCTTCGTCCCAGGTACTGATTCC; ef2-q-F:GTCTCCCCACACGGATGGGCTTT; EF2-q-R: ATCTTGAATTTCTCTCCATACATCATTT।

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Representative Results

कृत्रिम भोजन स्थापना और लार संग्रह की योजनाबद्ध
चित्रा 1A में लार को इकट्ठा करने के लिए फीडिंग चैंबर के रूप में उपयोग किए जाने वाले ग्लास सिलेंडर (15 सेमी x 2.5 सेमी) को दर्शाया गया है। सबसे पहले, एसबीपीएच लार्वा को संग्रह दक्षता में सुधार करने के लिए कई घंटों तक भूखा रखा गया था और फिर 5 मिनट के लिए हल्का करके स्थिर किया गया था। कीड़ों को कांच के सिलेंडर में स्थानांतरित करने के बाद, कक्ष के दोनों खुले सिरों को फैला हुआ पैराफिन झिल्ली से ढका गया था। एक छोर पर, 5% सुक्रोज के 200 माइक्रोन को पैराफिन झिल्ली की दो परतों के बीच सैंडविच किया गया था जो इसके मूल क्षेत्र(चित्रा 1B)को दोगुना करने के लिए बढ़ाया गया था। कक्ष पन्नी के साथ कवर किया गया था, लेकिन कृत्रिम आहार के साथ अंत प्रकाश के संपर्क में था। क्योंकि एसबीपीएच फोटोट्रॉपिक व्यवहार प्रदर्शित करता है, अंत में इकट्ठे हुए भूखे कीड़े प्रकाश के संपर्क में थे और फैला आंतरिक पैराफिन झिल्ली के माध्यम से कृत्रिम आहार समाधान पर खिलाया जाता था। इसके आधार पर, लार को कृत्रिम आहार में छोड़ा जा सकता है, जिसे प्रत्येक दिन एकत्र किया जाता था। पैराफिल्म-डाइट डिवाइस को हर दिन एक नए से बदल दिया गया । इस तरह, कृत्रिम आहार 5 दिनों से 2 सप्ताह के लिए एकत्र किया गया था, और फिर पूरे नमूने को 10 केडी सेंट्रल फिल्टर(चित्रा 1C)का उपयोग करके 100 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में केंद्रित किया गया था। लार के संग्रह के दौरान, SBPH के जीवित रहने की दर 5% सुक्रोज खिलाने की गणना की गई थी। पहले 4 दिनों में, 80% से अधिक एसबीपीएच बच गए। हालांकि,5 दिन बाद से, मृत्यु दर तेजी से बढ़कर 40% हो गई, और7 वें दिन(चित्रा 1D)पर आधे से भी कम एसबीपीएच बच गए। पर्याप्त लार एकत्र करने के लिए, ताजा एसबीपीएच को4 दिन आपूर्ति करने का सुझाव दिया गया था।

एकत्र लार प्रोटीन का सत्यापन
इस संग्रह विधि की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए, लार के नमूने को प्रोटीन विश्लेषण के अधीन किया गया था। सबसे पहले, प्रोटीन एसडीएस-पेज द्वारा अलग किए गए थे, और फिर चांदी के धुंधला(चित्रा 2A)द्वारा पता लगाया गया था। नकारात्मक नियंत्रण (5% सुक्रोज) की तुलना में, आरएसवी-संक्रमित एसबीपीएच लार से केंद्रित लार के नमूनों में कई प्रोटीन शामिल थे जिनका आगे विश्लेषण किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा। आरएसवी के प्राथमिक कीट वेक्टर के रूप में, एसबीपीएच वायरस को अपने चूसने-भेदी खिलाने की प्रक्रिया के माध्यम से पौधों तक पहुंचाता है। आरएसवी की सफल रिहाई लार स्राव से संबंधित है, और आरएसवी को उग्र कीड़ों की लार में एक आवश्यक कारक माना जाता है। यहां, आरएसवी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ गैर-संक्रमित और उग्र कीड़ों को इकट्ठा करने के बाद लार का परीक्षण किया गया और वीरुलिफेरसनमूने (चित्रा 2 बी)में आरएसवी कोट प्रोटीन (सीपी) का सफलतापूर्वक पता लगाया गया। एक अन्य अध्ययन में पाया गया कि मसिन प्रोटीन हेमिप्टरन कीटों में आवश्यक जेल लार प्रोटीन हैं ताकि23को खिलाने के लिए म्यान के गठन का ध्यान किया जा सके । इस बात की पुष्टि करने के लिए कि एसबीपीएच भी एक म्यूसिन प्रोटीन पैदा करता है, एक ख्यात म्यूसिन-एन्कोडिंग जीन का पूरा खुला पठन फ्रेम एसबीपीएच की लार ग्रंथि से निकाले गए आरएनए से परिलक्षित होता था । इसके अनुक्रम का उपयोग एसबीपीएच28के जीनोम अनुक्रम के खिलाफ ब्लास्ट विश्लेषणों में क्वेरी के रूप में किया गया था । एलएसजीएमपी नाम के 2175 बीपी वाले जीन की पहचान की गई। इस प्रोटीन के खिलाफ एक एंटीबॉडी पहले तैयार किया गया था और पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा एकत्र नमूने में प्रोटीन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । गैर-संक्रमित और उग्र रूपिक नमूनों में 78 केडी प्रोटीन का पता चला, जो यह प्रदर्शित करता है कि एलएसजीएमपी लार प्रोटीन(चित्रा 2सी)है। इसके बाद, विभिन्न ऊतकों (लार ग्रंथि, आंत, और शेष शरीर) में एलएसजीएमपी के प्रतिलिपि स्तर क्यूआरटी-पीसीआर द्वारा निर्धारित किए गए थे। परिणामों से पता चला है कि जीन ट्रांसक्रिप्ट स्तर आंत और शरीर के अन्य अंगों(चित्रा2 डी) की तुलना में लार ग्रंथि में 20 गुना अधिक था, लार ग्रंथि में LssgMP की विशिष्ट अभिव्यक्ति की पुष्टि ।

Figure 1
चित्रा 1:कृत्रिम आहार पर एसबीपीएच की अनुमति देने के लिए पैराफिन झिल्ली सैंडविच के साथ फीडिंग चैंबर का आरेख। (ए)कृत्रिम भोजन कक्ष का चित्रण। सिलेंडर 15.0 सेमी लंबा और व्यास में 2.5 सेमी है। कक्ष के एक छोर पर पैराफिन झिल्ली सैंडविच है; दूसरा छोर और टिन पन्नी कागज (तिरछा लाइनों) के साथ कवर सिलेंडर दीवार टिन पन्नी कागज के साथ कवर डिवाइस का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रकाश स्रोत कृत्रिम आहार पर फ़ीड करने के लिए SBPH को आकर्षित करने के लिए सेट किया गया था । (ख)पैराफिन सैंडविच का डायग्राम जिसमें कृत्रिम आहार होता है। 5% सुक्रोज जलीय समाधान के 200 μL पैराफिन झिल्ली की दो परतों के बीच सैंडविच किया गया था लगभग अपने मूल क्षेत्र को दोगुना करने के लिए फैला है। (ग)10 केडी सेंट्रलाइज्ड फिल्टर का उपयोग करके एकत्र लार की एकाग्रता। (घ)5% सुक्रोज पर एसबीपीएच फीडिंग की जीवित रहने की दर। मतलब और एसईएम की गणना तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ चार जैविक प्रतिकृति से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2-एकत्रित लार प्रोटीन का सत्यापन। (A)लार प्रोटीन चांदी धुंधला द्वारा पता लगाने । 5% सुक्रोज नकारात्मक नियंत्रण है। (ख)पश्चिमी दाग विश्लेषण द्वारा एकत्र लार में चावल धारी वायरस कोट प्रोटीन (सीपी) का पता लगाना । (ग)एकत्र लार में एलएसजीएमपी की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए पश्चिमी धब्बा। (घ) एल स्ट्राटेलसकी लार ग्रंथि में एलएसजीएमपी की विशिष्ट अभिव्यक्ति । ef2:एसबीपीएच का अनुवाद विस्तार कारक 2। मतलब और एसईएम की गणना तीन तकनीकी प्रतिकृति के साथ चार जैविक प्रतिकृति से की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कृत्रिम आहार पर कीटों के सफल पालन की सूचना सबसे पहले 1962 में दी गई थी जब मिटलर और देड ने29,30कृत्रिम आहार धारण करने के लिए पैराफिन झिल्ली तकनीक का वर्णन किया था । और इस विधि कीट जीव विज्ञान और व्यवहार के कई पहलुओं में पता लगाया गया है, उदाहरण के लिए, पोषक तत्व पूरक, dsRNA खिला, और वायरस अधिग्रहण । लार विश्लेषण की आवश्यकताओं के आधार पर, इस अध्ययन में एसबीपीएच की लार एकत्र करने के लिए सामान्य कृत्रिम आहार के रूप में 5% सुक्रोज का उपयोग किया जाता है। सफल लार संग्रह के लिए, कई महत्वपूर्ण कदम यहां टिप्पण लायक हैं। सबसे पहले, लार संग्रह की दक्षता सुनिश्चित करने के लिए उन्हें कक्ष में पेश करने से पहले प्रयोगात्मक कीड़ों को भूखा रखना आवश्यक है। दूसरा, स्टाइल वातावरण की नकल करने के लिए, एक दो परत पैराफिन सैंडविच बनाया जाता है। जब SBPH कृत्रिम आहार पर फ़ीड, लार म्यान आहार का सामना करना पड़ अंदर अंत में रूपों, और पानी लार बाद में स्रावित किया जाता है । तीसरा, एकत्र किए गए नमूने में माइक्रोबियल संदूषण को कम करने के लिए एक कृत्रिम माध्यम एकत्र किया जाना चाहिए और समय पर आदान-प्रदान किया जाना चाहिए । अंत में, कृत्रिम आहार को बदलते समय कीड़ों के नुकसान से बचने के लिए 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कीड़ों को एनेस्थेट करना आवश्यक है।

अधिकांश कृत्रिम आहार के विपरीत जिसमें अमीनो एसिड, विटामिन और कार्बोहाइड्रेट होते हैं, 5% सुक्रोज माध्यम के फायदे उल्लेखनीय हैं। सबसे पहले, इसे तैयार करना आसान है। दूसरा, आहार की सरल संरचना का मतलब है लार में विभिन्न कारकों के आगे विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप करने के लिए कुछ पदार्थ। फिर भी, सामान्य कृत्रिम आहार(चित्रा 1D)के रूप में 5% सुक्रोज का उपयोग करके फीडिंग अवधि के अंतिम दिनों में एसबीपीएच के जीवित रहने के अनुपात में गिरावट आई। इस दोष पर काबू पाने के लिए, पर्याप्त लार के लिए समय पर ताजा एसबीपीएच की आपूर्ति की जानी चाहिए। और भोजन व्यवहार या वायरस संचरण पर लार समारोह के आगे के शोध के लिए, लार संग्रह अवधि सही समय तक सीमित होना चाहिए इससे पहले कि कीड़ों की मृत्यु दर innutrition के कारण वृद्धि हुई । यह कृत्रिम माध्यम की एक आम सीमा प्रतीत होती है। कुछ अन्य अध्ययनों में पाया गया कि रासायनिक रूप से परिभाषित आहार डी-97 पर पाला एन लुगेन्स का अस्तित्व अतिसंवेदनशील चावल किस्म TN1 पर उठाए गए लोगों से कम था, जिसका अर्थ है कि मूल मेजबान सिर्फ खाद्य वेक्टर कीड़ों से अधिक की आपूर्ति करता है। और कई अध्ययनों ने पालन दक्षता में सुधार करने के लिए कीड़ों के निरंतर भोजन के लिए रासायनिक रूप से परिभाषित आहार को अनुकूलित करने पर ध्यान केंद्रित किया है।

लार ग्रंथि का ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण लार प्रोटीन पहचान के लिए एक पारंपरिक तरीका है। और ए पिसम और एम पर्सिका14,31की एक ही प्रजाति में विभिन्न लार प्रोटीन का पता लगाया गया है और लार प्रोटीन की प्रचुरता उनके पता लगाने की आवृत्ति32निर्धारित करती है। हालांकि लार में संदिग्ध प्रोटीन की जांच के लिए एक वैध तरीका की कमी थी । यह पैराफिन झिल्ली सैंडविच विधि ट्रांसक्रिप्टोम विश्लेषण द्वारा पहचाने गए संदिग्ध लार प्रोटीन की पुष्टि करने के लिए एक अभिनव तरीका प्रदान करती है, जो एलएसएसजीपी(चित्रा 2 सी)का पता लगाकर आगे साबित होती है। इसके अलावा, प्रोटीन विश्लेषण ने पुष्टि की कि एकत्र लार(चित्रा 2 ए)में प्रचुर मात्रा में प्रोटीन मौजूद हैं, जो आगे के विश्लेषण के लिए पर्याप्त मात्रा में है, उदाहरण के लिए, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री। एकत्र लार का प्रोटेओमिक्स विश्लेषण SBPH के खिला चरण में शामिल गुप्त कारकों की पहचान करने के लिए एक प्रत्यक्ष और प्रभावी तरीका होगा, झूठी सकारात्मक अनावश्यक प्रोटीन का पता लगाने के जोखिम को कम करने ।

लार कीट से पौधों की मेजबानी करने के लिए वायरस वाहक के रूप में काम करता है और वेक्टर-वायरस-संयंत्र बातचीत14,33,34का एक अनिवार्य घटक है। कीट वैक्टर से जारी वायरस का टाइटर मेजबान के लिए संक्रमण के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। संक्रमित पौधों में वायरल टाइटर का परीक्षण करने वाले अप्रत्यक्ष तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल सीधे viruliferous SBPH(चित्रा 2B)द्वारा जारी आरएसवी का पता लगा सकता है। इस पैराफिन झिल्ली सैंडविच विधि द्वारा समर्थित, आरएसवी-मुक्त और आरएसवी-संक्रमित कीड़ों से एकत्र लार प्रोटीन के आगे तुलनात्मक विश्लेषण भी वायरस-संयंत्र-वेक्टर इंटरैक्शन में शामिल संभावित उम्मीदवारों को प्रकट कर सकते हैं।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (नंबर 32072385) और यूथ इनोवेशन प्रमोशन एसोसिएशन सीएएस (2021084) द्वारा चीन के नेशनल प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (नंबर 2019YFC1200503) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

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References

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जीव विज्ञान अंक 174
<em>लाओडेल्फैक्स स्ट्राटेलस</em> लार संग्रह के लिए दो स्तरित झिल्ली सैंडविच विधि
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Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

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