מיקרוסקופיה ישירה לשחזור אופטי סטוכאסטי של שלשלות חוץ-תאיות בשלושה ממדים
Summary
מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) משמשת לעקיפת מגבלת עקיפה אופיינית של מיקרוסקופיית אור ולהציג אקסוזומים בסולם הננומטר. זה יכול להיות מועסק בשניים ושלושה ממדים כדי לאפיין אקסוזומים.
Abstract
שלל חוץ-תאי (EVs) משוחררים על ידי כל סוגי התאים וממלאים תפקיד חשוב באיתות התא ובהומאוסטזיס. ההדמיה של EVs דורשת לעתים קרובות שיטות עקיפות בשל הקוטר הקטן שלהם (40-250 ננומטר), שהוא מתחת לגבול העקיפה של מיקרוסקופיית אור טיפוסית. פיתחנו הדמיה מבוססת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר של EVs כדי לעקוף את מגבלת עקיפה בשניים ושלושה ממדים. באמצעות גישה זו, אנו יכולים לפתור את הצורה התלת ממדית של EVs בתוך +/- 20 ננומטר רזולוציה על ציר XY ו + / – 50 ננומטר רזולוציה לאורך ציר Z. לסיכום, אנו מציעים כי מיקרוסקופיה ברזולוציית-על תיחשב כשיטת אפיון של EVs, כולל אקסוזומים, כמו גם וירוסים עטופים.
Introduction
שלל חוץ-תאי (EVs) הם שלוקים הקשורים בממברנה המשתחררים על ידי כל סוגי התאים. הם מכילים שומנים, חלבונים, מטבוליטים וחומצות גרעין ומעבירים חומרים אלה באופן מקומי בין תאים ומעבירים בין רקמות ואיברים. ישנם שלושה תתי סוגים עיקריים של EVs: גופים אפופוטוטיים, microvesicles, ו exosomes1,2. כאן, אנו ממקדים את הדיון שלנו על אקסוזומים והחלבונים הקשורים שלהם.
אקסוזומים הם שלל מופרש שמקורו בהתפתחות הפנימית של אנדוזומים מוקדמים לתוך הגוף הרב-לשוני (MVB). לאחר מכן MVB מתמזג עם קרום הפלזמה, משחרר את exosomes לתוך החלל החוץ תאי לנסוע לתאים אחרים3,4. אקסוזומים קיימים על ספקטרום של גדלים הנעים בין 40 ל -150 ננומטר ומועשרים בחלבוני טרנס-מברן אנדוסומלית המכונים טטרספנינים (CD9, CD63, CD81), קומפלקס מיון אנדוסומאלי הקשור לממברנה הנדרש להובלה (ESCRT), וחלבונים הקשורים לרפסודה של שומנים1,2,5,6,7.
אפיון ההרכב הביוכימי של אקסוזומים הפך לתחום פופולרי עבור חוקרים להבין טוב יותר את האופי התפקודי שלהם. קיימות שיטות רבות להדמיה ואפיון אקסוזומים, כולל ציטומטריית זרימה ננומטרית, ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA), מיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה ושידור (TEM), תהודה פלסמון פני השטח, חישת דופק התנגדותית ומיקרוסקופיה אור מסורתית, שכל אחד מהם מכיל יתרונות פנימיים וחסרונות8,9. TEM ו- cryo-EM יכולים להשיג רזולוציה מבוססת ננומטר, אך לעתים קרובות דורשים צעדי התייבשות ושבר בהקפאה, ובכך מתכווצים או מתרוממים EVs10,11. NTA מסתמכת על פיזור אור, המאפשר אפיון של מאות EVs בכל פעם, אבל היא מדידה עקיפה של גודל החלקיקים ולא יכול להבחין בקלות בין EVs, וירוסים, וחלבון אגרגטים12,13,14,15,16. ציטומטריית זרימה ננומטרית משתמשת בפיזור אור מנתיב עירור, אשר לאחר מכן ניתן לתרגם למדידות גודל, אבל היא טכנולוגיה מתפתחת, ויש קונצנזוס קטן על מה גודל החלקיקים נמצאים בטווח הליניארי של זיהוי עבור מכשירים שונים12,17,18.
מיקרוסקופיה אור מסורתית באמצעות חלבונים או צבעים פלואורסצנטיים הייתה אחת הטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים תת-תאיים, מתחמי חלבון ומכונות איתות בתוך תא. בעוד טכניקה זו מוכיחה שימושית לדמיין את לוקליזציה של מתחמים, מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיה אור מסורתית (סביב 250-400 ננומטר) מונעת את הרזולוציה הברורה של חלבונים או מבנים בטווח הגודל הטיפוסי של exosome (40-150 ננומטר)12,19,20.
מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, כלומר, מיקרוסקופיה שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM), מבדילה את עצמה ממיקרוסקופיה קלה קונבנציונלית על ידי שימוש בתכונות הניתנות לצילום של פלואורופורים ספציפיים וזיהוי אירועים מהבהבים אלה כדי לשחזר תמונות עד לדיוק ננומטר21. אירועים של פוטו-וויצ’ינג נאספים באמצעות מצלמת זיהוי בקצב גבוה במהלך עשרות אלפי חשיפות בודדות, ופונקציית התפשטות נקודה משמשת למיפוי בביטחון רב את המיקום המדויק של הפלורופור השוטף19,20,22. זה מאפשר dSTORM לעקוף את מגבלת עקיפה של מיקרוסקופיית אור. מספר קבוצות דיווחו על שימוש בטכניקות ברזולוציית-על להדמיה ומעקב אחר אקסוזומים והחלבונים הקשורים22,23,24,25. הרזולוציה הסופית תלויה בתכונות הביופיסיות של הפלואורופור, אך לעתים קרובות נעה בין +/-10-100 ננומטר לאורך ציר ה-XY, ומאפשרת רזולוציה של מולקולה אחת.
היכולת לפתור פלואורופורים בודדים בקנה מידה זה על ציר XY חוללה מהפכה במיקרוסקופיה. עם זאת, יש מעט נתונים על dSTORM תלת מימדי (תלת-ממדי) של אקסוזום. לכן, ביקשנו לקבוע נוהל הפעלה סטנדרטי (SOP) להדמיה ואפיון מבוססי dSTORM של EVs מטוהרים, כולל אקסוזומים לדיוק ננומטר בתלת-ממד.
Protocol
Representative Results
Discussion
רכבים הסביבה הפכו לתחום מחקר פופולרי בשל תפקידם החשוב בתהליכים תאיים רבים ובאיתות מתא לתא1,30. עם זאת, ההדמיה שלהם מוכיחה להיות קשה כמו הגודל הקטן שלהם נופל מתחת לגבול עקיפה של מיקרוסקופיה אור. מיקרוסקופיה של שחזור אופטי סטוכסטי ישיר (dSTORM) היא שיטה ישירה להדמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ל-Oxford Nanoimaging על המשוב וההדרכה הבונים שלהם. עבודה זו מומנה על ידי 5UM1CA121947-10 ל R.P.M. ואת 1R01DA040394 ל D.P.D.D.
Materials
| 15 µ-Slide 8 well plates | Ibidi | 80827 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190-144 | |
| 1X Penicillin Streptomycin solution | Gibco | 15140-122 | |
| 50 mL conical tube | Thermo Fisher | 339652 | |
| 500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus | Genesee | 25-227 | |
| 750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter | Cytiva | 29-0142-95 | |
| AKTA Flux S | Cytiva | 29-0384-37 | |
| AKTA Start | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Anti-CD81 magnetic beads | Thermo Fisher | 10616D | |
| B-cubed buffer | ONI | BCA0017 | |
| CellMask Red | Thermo Fisher | C10046 | |
| Dubelco's Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10566016 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 97068-085 | |
| Frac 30 Fraction collector | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW | |
| Glycine pH=2.0 | Thermo Fisher | BP381-5 | |
| HiTrap CaptoCore 700 Column | Cytiva | 17548151 | |
| Molecular Biology Grade Water | Corning | 9820003 | |
| Nanoimager | Oxford Nanoimaging | Custom | |
| Paraformaldehhyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Polyethylene glycol | Thermo Fisher | BP233-1 | |
| RNase A | Promega | A797C | |
| T175 Flasks | Genesee | 25-211 | |
| Tetraspek microspheres | Invitrogen | T7279 | |
| Tris- HCl pH=7.5 | Thermo Fisher | BP153-1 | |
| Unicorn V | Cytiva | 29022094-ECOMINSSW |
Referências
- Pegtel, D. M., Gould, S. J. Exosomes. Annual Review of Biochemistry. 88, 487-514 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Théry, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. Exosomes: composition, biogenesis and function. Nature Reviews. Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).
- Cocozza, F., Grisard, E., Martin-Jaular, L., Mathieu, M., Théry, C. SnapShot: Extracellular vesicles. Cell. 182 (1), 262 (2020).
- Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 255-289 (2014).
- McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Extracellular vesicles in virus infection and pathogenesis. Current Opinion in Virology. 44, 129-138 (2020).
- Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions. EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).
- Akers, J. C., et al. Comparative analysis of technologies for quantifying Extracellular Vesicles (EVs) in Clinical Cerebrospinal Fluids (CSF). PLoS One. 11 (2), 0149866 (2016).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
- Emelyanov, A., et al. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid. PLoS One. 15 (1), 0227949 (2020).
- Noble, J. M., et al. Direct comparison of optical and electron microscopy methods for structural characterization of extracellular vesicles. Journal of Structural Biology. 210 (1), 107474 (2020).
- Panagopoulou, M. S., Wark, A. W., Birch, D. J. S., Gregory, C. D. Phenotypic analysis of extracellular vesicles: a review on the applications of fluorescence. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1710020 (2020).
- Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. Critical evaluation of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates. Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).
- Carnell-Morris, P., Tannetta, D., Siupa, A., Hole, P., Dragovic, R. Analysis of extracellular vesicles using fluorescence nanoparticle tracking analysis. Methods in Molecular Biology. 1660, 153-173 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Bachurski, D., et al. Extracellular vesicle measurements with nanoparticle tracking analysis – An accuracy and repeatability comparison between NanoSight NS300 and ZetaView. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1596016 (2019).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lannigan, J., Erdbruegger, U. Imaging flow cytometry for the characterization of extracellular vesicles. Methods. 112, 55-67 (2017).
- Magenau, A., Gaus, K. 3D super-resolution imaging by localization microscopy. Methods in Molecular Biology. 1232, 123-136 (2015).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nature Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Chen, C., et al. Imaging and intracellular tracking of cancer-derived exosomes using single-molecule localization-based super-resolution microscope. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (39), 25825-25833 (2016).
- Grant, M. J., Loftus, M. S., Stoja, A. P., Kedes, D. H., Smith, M. M. Superresolution microscopy reveals structural mechanisms driving the nanoarchitecture of a viral chromatin tether. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4992-4997 (2018).
- Nizamudeen, Z., et al. Rapid and accurate analysis of stem cell-derived extracellular vesicles with super resolution microscopy and live imaging. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Cell Research. 1865 (12), 1891-1900 (2018).
- Shen, X., et al. 3D dSTORM imaging reveals novel detail of ryanodine receptor localization in rat cardiac myocytes. The Journal of Physiology. 597 (2), 399-418 (2019).
- McNamara, R. P., et al. Large-scale, cross-flow based isolation of highly pure and endocytosis-competent extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1541396 (2018).
- Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Swartzendruber, J. A., Kaminski, A. Anaerobic growth and maintenance of mammalian cell lines. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (137), (2018).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Science Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Mönkemöller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 16 (24), 12576-12581 (2014).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Théry, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
- Hu, Y. S., Cang, H., Lillemeier, B. F. Superresolution imaging reveals nanometer- and micrometer-scale spatial distributions of T-cell receptors in lymph nodes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (26), 7201-7206 (2016).
- Jayasinghe, I., et al. True molecular scale visualization of variable clustering properties of ryanodine receptors. Cell Reports. 22 (2), 557-567 (2018).
- Eggert, D., Rösch, K., Reimer, R., Herker, E. Visualization and analysis of hepatitis C virus structural proteins at lipid droplets by super-resolution microscopy. PLoS One. 9 (7), 102511 (2014).
- Mazloom-Farsibaf, H., et al. Comparing lifeact and phalloidin for super-resolution imaging of actin in fixed cells. PLoS One. 16 (1), 02246138 (2021).
- Huang, B., Jones, S. A., Brandenburg, B., Zhuang, X. Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature Methods. 5 (12), 1047-1052 (2008).
- McNamara, R. P., et al. Nef secretion into extracellular vesicles or exosomes is conserved across human and simian immunodeficiency viruses. mBio. 9 (1), 02344 (2018).
- Blom, H., et al. Efficient chromatographic reduction of ovalbumin for egg-based influenza virus purification. Vaccine. 32 (30), 3721-3724 (2014).
- Kalies, S., Kuetemeyer, K., Heisterkamp, A. Mechanisms of high-order photobleaching and its relationship to intracellular ablation. Biomedical Optics Express. 2 (4), 805-816 (2011).
- Mönkemöller, V., Øie, C., Hübner, W., Huser, T., McCourt, P. Multimodal super-resolution optical microscopy visualizes the close connection between membrane and the cytoskeleton in liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. Scientific Reports. 5, 16279 (2015).
- Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81, 1-27 (2017).
- Godin, A. G., Lounis, B., Cognet, L. Super-resolution microscopy approaches for live cell imaging. Biophysical Journal. 107 (8), 1777-1784 (2014).
- Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Optics Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
- Hurwitz, S. N., et al. CD63 regulates Epstein-Barr Virus LMP1 exosomal packaging, enhancement of vesicle production, and noncanonical NF-κB signaling. Journal of Virology. 91 (5), 02251 (2017).
- Hurwitz, S. N., Cheerathodi, M. R., Nkosi, D., York, S. B., Meckes, D. G. Tetraspanin CD63 bridges autophagic and endosomal processes to regulate exosomal secretion and intracellular signaling of Epstein-Barr Virus LMP1. Journal of Virology. 92 (5), 01969 (2018).
- Bukong, T. N., Momen-Heravi, F., Kodys, K., Bala, S., Szabo, G. Exosomes from hepatitis C infected patients transmit HCV infection and contain replication competent viral RNA in complex with Ago2-miR122-HSP90. PLoS Pathogens. 10 (10), 1004424 (2014).
- Khan, M. B., et al. Nef exosomes isolated from the plasma of individuals with HIV-associated dementia (HAD) can induce Aβ(1-42) secretion in SH-SY5Y neural cells. J Neurovirology. 22 (2), 179-190 (2016).
- Lee, J. H., et al. HIV-Nef and ADAM17-containing plasma extracellular vesicles induce and correlate with immune pathogenesis in chronic HIV infection. EBioMedicine. 6, 103-113 (2016).
- Meckes, D. G., et al. Modulation of B-cell exosome proteins by gamma herpesvirus infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 2925-2933 (2013).
- Raymond, A. D., et al. Microglia-derived HIV Nef+ exosome impairment of the blood-brain barrier is treatable by nanomedicine-based delivery of Nef peptides. Journal of Neurovirology. 22 (2), 129-139 (2016).
- Raab-Traub, N., Dittmer, D. P. Viral effects on the content and function of extracellular vesicles. Nature Reviews Microbiology. 15 (9), 559-572 (2017).
- Feng, Z., et al. A pathogenic picornavirus acquires an envelope by hijacking cellular membranes. Nature. 496 (7445), 367-371 (2013).
- Bandopadhyay, M., Bharadwaj, M. Exosomal miRNAs in hepatitis B virus related liver disease: a new hope for biomarker. Gut Pathogens. 12, 23 (2020).
- Hurwitz, S. N., et al. Proteomic profiling of NCI-60 extracellular vesicles uncovers common protein cargo and cancer type-specific biomarkers. Oncotarget. 7 (52), 86999-87015 (2016).
- Rodrigues, M., Fan, J., Lyon, C., Wan, M., Hu, Y. Role of extracellular vesicles in viral and bacterial infections: Pathogenesis, diagnostics, and therapeutics. Theranostics. 8 (10), 2709-2721 (2018).
