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Biologia

Microscopia de Reconstrução Óptica Estocástica Direta de Vesículos Extracelulares em Três Dimensões

Published: August 26, 2021
doi:
10.3791/62845
, ,
1Department of Microbiology and Immunology, Lineberger Comprehensive Cancer Center,The University of North Carolina at Chapel Hill School of Medicine

Summary

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é usada para contornar o limite típico de difração de microscopia leve e para visualizar exosóis na escala de nanômetros. Pode ser empregado em duas e três dimensões para caracterizar exossomos.

Abstract

Vesículos extracelulares (EVs) são liberados por todos os tipos de células e desempenham um papel importante na sinalização celular e homeostase. A visualização de EVs muitas vezes requer métodos indiretos devido ao seu pequeno diâmetro (40-250 nm), que está abaixo do limite de difração da microscopia de luz típica. Desenvolvemos uma visualização de EVs baseada em microscopia de super resolução para contornar o limite de difração em duas e três dimensões. Usando esta abordagem, podemos resolver a forma tridimensional dos EVs para dentro de resolução de +/- 20 nm no eixo XY e resolução de +/- 50 nm ao longo do eixo Z. Em conclusão, propomos que a microscopia de super resolução seja considerada como um método de caracterização de EVs, incluindo exosósmos, bem como vírus envoltos.

Introduction

Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à membrana liberadas por todos os tipos de células. Eles contêm lipídios, proteínas, metabólitos e ácidos nucleicos e transferem esses materiais localmente entre as células e distally entre tecidos e órgãos. Existem três subtipos primários de EVs: corpos apoptóticos, microvesículos e exosóis1,2. Aqui, focamos nossa discussão sobre exossomos e suas proteínas associadas.

Exosóis são vesículas secretadas originárias do brotamento interno de endosários primitivos no corpo multivesicular (MVB). O MVB então se funde com a membrana plasmática, liberando os exossomos no espaço extracelular para viajar para outras células3,4. Os exosóis existem em um espectro de tamanhos que variam de 40 a 150 nm e são enriquecidos com proteínas transmembranas endossomais conhecidas como tetraspaninas (CD9, CD63, CD81), complexo de triagem endosômico ligado à membrana necessário para o transporte (ESCRT), e proteínas lipídicas associadas à balsa1,2,5,6,7.

Caracterizar a composição bioquímica dos exossomos tornou-se um campo popular para os pesquisadores entenderem melhor sua natureza funcional. Existem muitos métodos para visualizar e caracterizar exossomos, incluindo citometria de fluxo nanoescala, análise de rastreamento de nanopartículas (NTA), microscopia eletrônica de varredura e transmissão (TEM), ressonância de plasmon superficial, sensoriamento de pulso resistivo e microscopia de luz tradicional, cada uma das quais contém prós intrínsecos e contras8,9. TEM e crio-EM podem alcançar resolução baseada em nanômetros, mas muitas vezes requerem etapas de desidratação e fratura congelante, diminuindo ou reduzindo os EVs10,11. O NTA conta com a dispersão de luz, permitindo a caracterização de centenas de EVs de cada vez, mas é uma medição indireta do tamanho das partículas e não pode distinguir facilmente entre EVs, vírus e agregados proteicos12,13,14,15,16. A citometria de fluxo nanoescala emprega a dispersão de luz a partir de um caminho de excitação, que pode então ser traduzido em medidas de tamanho, mas é uma tecnologia emergente, e há pouco consenso sobre o tamanho das partículas dentro da faixa linear de detecção para vários instrumentos12,17,18.

A microscopia leve tradicional usando proteínas fluorescentes ou corantes tem sido uma das técnicas mais utilizadas para visualizar compartimentos subcelulares, complexos proteicos e máquinas de sinalização dentro de uma célula. Embora essa técnica se mostre útil na visualização da localização de complexos, o limite de difração da microscopia de luz tradicional (em torno de 250-400 nm) impede a clara resolução de proteínas ou estruturas na faixa de tamanho típico de um exososomo (40-150 nm)12,19,20.

A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM), distingue-se da microscopia de luz convencional, empregando as propriedades fotosssuráveis de fluoroforos específicos e detectando esses eventos piscando para reconstruir imagens até a precisão de nanômetros21. Eventos de captura de fotos são coletados usando uma câmera de detecção de alta moldura ao longo de dezenas de milhares de exposições individuais, e uma função de propagação de pontos é usada para mapear com alta confiança a localização exata do fluoróforo de fotossar19,20,22. Isso permite que o dSTORM contorne o limite de difração da microscopia leve. Vários grupos relataram o uso de técnicas de super-resolução para visualização e rastreamento de exossomos e suas proteínas associadas22,23,24,25. A resolução final depende das propriedades biofísicas do fluoróforo, mas muitas vezes varia de +/-10-100 nm ao longo do eixo XY, permitindo a resolução de molécula única.

A capacidade de resolver fluoroforos individuais nesta escala no eixo XY revolucionou a microscopia. No entanto, há poucos dados sobre o dSTORM tridimensional (3-D) de um exossomo. Por isso, buscamos estabelecer um procedimento operacional padrão (SOP) para visualização e caracterização baseada em dSTORM de EVs purificados, incluindo exosóis à precisão de nanômetros em 3D.

Protocol

1 Propagação e manutenção de linhas celulares Adquira células de osteossarcoma humanas (U2OS) e coloque as células no meio de crescimento suplementadas com soro bovino fetal livre de 10% e 1x solução de penicilina/estreptomicina.NOTA: O Soro Bovino Fetal livre de exosome foi gerado seguindo o protocolo apresentado em McNamara et. al.26. Mantenha as células U2OS em uma incubadora revestida de cobre a 37 °C em 5% de CO2 e células de passagem em frascos T…

Representative Results

O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da microscopia de super resolução na visualização de EVs individuais com resolução de nanômetros em três dimensões (3D). Para analisar a forma e o tamanho dos EVs individuais, utilizamos corante fotocrável e incubamos os EVs com um corante de intercalação de membrana e removeram o excesso de corante através da cromatografia29. Os EVs anti-CD81 capturados por afinidade e vermelho foram então vistos no microscópio de super resolução so…

Discussion

Os EVs tornaram-se uma área de estudo popular devido ao seu importante papel em muitos processos intracelulares e sinalização celular-celular1,30. No entanto, sua visualização se mostra difícil, pois seu pequeno tamanho fica abaixo do limite de difração da microscopia leve. A microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM) é um método direto de visualização que contorna o limite de difração capturando eventos de fotofraco de fluor…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer a Oxford Nanoimaging por seu feedback e orientação construtivas. Este trabalho foi financiado pelo 5UM1CA121947-10 para R.P.M. e o 1R01DA040394 para D.P.D.

Materials

15 µ-Slide 8 well plates Ibidi 80827
1X PBS Gibco 14190-144
1X Penicillin Streptomycin solution Gibco 15140-122
50 mL conical tube Thermo Fisher 339652
500 mL 0.22 µm vacuum filtration apparatus Genesee 25-227
750 kDa hollow-fiber cartridge cutoff filter Cytiva 29-0142-95
AKTA Flux S Cytiva 29-0384-37
AKTA Start Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Anti-CD81 magnetic beads Thermo Fisher 10616D
B-cubed buffer ONI  BCA0017
CellMask Red Thermo Fisher C10046
Dubelco's Modified Eagle Medium Thermo Fisher 10566016
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Frac 30 Fraction collector Cytiva 29022094-ECOMINSSW
Glycine pH=2.0 Thermo Fisher BP381-5
HiTrap CaptoCore 700 Column Cytiva 17548151
Molecular Biology Grade Water Corning 9820003
Nanoimager Oxford Nanoimaging Custom
Paraformaldehhyde Electron Microscopy Sciences 15710
Polyethylene glycol Thermo Fisher BP233-1
RNase A Promega A797C
T175 Flasks Genesee 25-211
Tetraspek microspheres Invitrogen T7279
Tris- HCl pH=7.5 Thermo Fisher BP153-1
Unicorn V Cytiva 29022094-ECOMINSSW
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Referências

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Chambers, M. G., McNamara, R. P., Dittmer, D. P. Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions. J. Vis. Exp. (174), e62845, doi:10.3791/62845 (2021).
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