Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos
Summary
Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.
Abstract
Los hongos entomopatógenos (EPF) son uno de los agentes de control microbiano para el manejo integrado de plagas. Para controlar las plagas locales o invasoras, es importante aislar y seleccionar el EPF autóctono. Por lo tanto, el método de cebo del suelo combinado con el sistema de cebo de insectos (gusano de la harina, Tenebrio molitor) se utilizó en este estudio con algunas modificaciones. Los EPF aislados fueron sometidos a la prueba de virulencia contra la plaga agrícola Spodoptera litura. Además, las cepas potenciales de EPF fueron sometidas a identificaciones morfológicas y moleculares. Además, se realizó el ensayo de producción de conidios y termotolerancia para las cepas EPF prometedoras y se comparó; estos datos se sustituyeron además por la fórmula del número de conidios efectivos (ECN) para la clasificación de laboratorio. El sistema de gusanos de la harina de cebo del suelo y la fórmula ECN se pueden mejorar reemplazando las especies de insectos e integrando más factores de estrés para la evaluación de la comercialización y la aplicación en el campo. Este protocolo proporciona un enfoque rápido y eficiente para la selección de EPF y mejorará la investigación sobre agentes de control biológico.
Introduction
Actualmente, los hongos entomopatógenos (EPF) son ampliamente utilizados en el control microbiano de plagas agrícolas, forestales y hortícolas. Las ventajas de EPF son sus amplias gamas de huéspedes, buena adaptabilidad ambiental, naturaleza ecológica y que se puede utilizar con otros productos químicos para mostrar el efecto sinérgico para el manejo integrado de plagas1,2. Para la aplicación como agente de control de plagas, es necesario aislar una gran cantidad de EPF de insectos enfermos o del entorno natural.
El muestreo de estos organismos de sus huéspedes ayuda a comprender la distribución geográfica y la tasa de prevalencia de EPF en huéspedes naturales3,4,5. Sin embargo, la colección de insectos infectados por hongos suele estar limitada por factores ambientales y poblaciones de insectos en el campo4. Teniendo en cuenta que los insectos huéspedes morirán después de la infección por EPF y luego caerán en el suelo, el aislamiento de EPF a partir de muestras de suelo podría ser un recurso estable3,6. Por ejemplo, se sabe que los saprófitos usan el huésped muerto como su recurso para el crecimiento. Los sistemas de cebo de suelo y medio selectivo se han utilizado ampliamente para detectar y aislar EPF del suelo3,4,7,8,9,10.
En el método del medio selectivo, la solución de suelo diluida se coloca en un medio que contiene antibióticos de amplio espectro (por ejemplo, cloranfenicol, tetraciclina o estreptomicina) para inhibir el crecimiento de bacterias2,3,9,11. Sin embargo, se ha informado que este método puede distorsionar la diversidad y densidad de la cepa y puede causar una sobreestimación o subestimación de muchas comunidades microbianas6. Además, las cepas aisladas son menos patógenas y compiten con los saprófitos durante el aislamiento. Es difícil aislar el EPF de la solución de suelo diluido3. En lugar de utilizar un medio selectivo, el método de cebo en el suelo aísla el EPF de los insectos muertos infectados, que puede almacenarse durante 2-3 semanas, proporcionando así un método de separación EPF más eficiente y estándar3,4,7,6. Debido a que el método es fácil de operar, se puede aislar una variedad de cepas patógenas a un bajo costo4. Por lo tanto, es ampliamente utilizado por muchos investigadores.
Al comparar los diferentes tipos de sistemas de cebo de insectos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae son las especies de EPF más comunes que se encuentran en insectos pertenecientes a Hemiptera, Lepidoptera, Blattella y Coleoptera6,12,13,14. Entre estos cebos de insectos, Galleria mellonella (orden Lepidoptera) y Tenebrio molitor (orden Coleoptera) muestran mayores tasas de recuperación de Beauveria y Metarhizium spp., en comparación con otros insectos. Por lo tanto, G. mellonella y T. molitor se utilizan comúnmente para el cebo de insectos. A lo largo de los años, el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) ha establecido una Biblioteca EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) que contiene una amplia variedad de especies, incluidas 4081 especies de Beauveria spp., 18 especies de Clonostachys spp., 878 especies de Cordyceps spp., 2473 especies de Metarhizium spp., 226 especies de Purpureocillium spp., y 13 especies de Pochonia spp. entre otras15. Otra Biblioteca EPF fue construida por el Laboratorio de Investigación de Entomología (ERL) de la Universidad de Vermont en los Estados Unidos durante aproximadamente 30 años. Incluye 1345 cepas de EPF de estados Unidos, Europa, Asia, África y Oriente Medio16.
Para controlar las plagas locales o de invasión en Taiwán, se requiere el aislamiento y la selección de EPF autóctonos. Por lo tanto, en este protocolo, hemos modificado y descrito el procedimiento del método de cebo del suelo y lo hemos combinado con el sistema de cebo de insectos (gusano de la harina, Tenebrio molitor)17. Sobre la base de este protocolo, se estableció una biblioteca EPF. Se realizaron dos rondas de cribado (cuantificación de la inoculación) para los aislados preliminares de EPF. Los aislados de EPF mostraron patogenicidad a los insectos. Las cepas potenciales fueron sometidas a identificaciones morfológicas y moleculares y analizadas posteriormente por el ensayo de termotolerancia y producción conidial. Además, también se propuso un concepto de número de conidios efectivo (ECN). Utilizando la fórmula ECN y el análisis de componentes principales (PCA), las cepas potenciales se analizaron bajo presión ambiental simulada para completar el proceso de establecimiento y detección de la biblioteca EPF. Posteriormente, se probó la patogenicidad de cepas prometedoras de EPF para la plaga objetivo (por ejemplo, Spodoptera litura). El protocolo actual integra datos de termotolerancia y producción conidial en la fórmula ECN y el análisis PCA, que se puede utilizar como un sistema de clasificación estándar para la investigación relacionada con EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los hongos entomopatógenos (EPF) se han utilizado para el control de insectos. Existen varios métodos para aislar, seleccionar e identificar EPF30,31,32. Comparando los diferentes tipos de métodos de cebo de insectos, Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae se encontraron comúnmente en cebos de insectos6,12,13,14.</s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por la Subvención 109-2313-B-005 -048 -MY3 del Ministerio de Ciencia y Tecnología (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referências
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
