Toprak Örneklerinden İntomopatojenik Mantarların İzolasyonu ve Seçimi ve Böcek Zararlılarına Karşı Mantar Virülansının Değerlendirilmesi
Summary
Burada, toprak örneklerinden entomopatojenik mantarların (EPF) izole edilmesi ve seçilmesi için kullanılan yemek kurdu (Tenebrio molitor)-yem sistemine dayanan bir protokol sunuyoruz. Sahada zararlı mikrobiyal kontrolü için fizyolojik özelliklere göre yüksek strese dayanıklı EPF seçmek için etkili bir konidia sayısı (ECN) formülü kullanılır.
Abstract
İntomopatojenik mantarlar (EPF), entegre haşere yönetimi için mikrobiyal kontrol ajanlarından biridir. Yerel veya istilacı zararlıları kontrol etmek için, yerli EPF’yi izole etmek ve seçmek önemlidir. Bu nedenle, bu çalışmada böcek yemi (yemek kurdu, Tenebrio molitor) sistemi ile birlikte toprak yem yöntemi bazı değişikliklerle kullanılmıştır. İzole EPF daha sonra tarım zararlısı Spodoptera litura’ya karşı virülans testine tabi tutuldu. Ayrıca, potansiyel EPF suşları morfolojik ve moleküler tanımlamalara tabi tutulmuştır. Ek olarak, konidia üretimi ve termotolerans tahlilleri umut verici EPF suşları için yapıldı ve karşılaştırıldı; bu veriler laboratuvar sıralaması için etkili konidia sayısı (ECN) formülüne daha da ikame edilmiştir. Toprak yemi-yemek kurdu sistemi ve ECN formülü, böcek türlerinin değiştirilmesi ve ticarileştirme ve saha uygulamasının değerlendirilmesi için daha fazla stres faktörü entegre edilerek geliştirilebilir. Bu protokol, EPF seçimi için hızlı ve verimli bir yaklaşım sağlar ve biyolojik kontrol ajanları üzerindeki araştırmaları geliştirecektir.
Introduction
Şu anda, entomopatojenik mantarlar (EPF) tarım, orman ve bahçecilik zararlılarının mikrobiyal kontrolünde yaygın olarak kullanılmaktadır. EPF’nin avantajları geniş konak çeşitleri, iyi çevresel adaptasyon kabiliyeti, çevre dostu doğası ve entegre haşere yönetimi için sinerjik etkiyi göstermek için diğer kimyasallarla birlikte kullanılabilmesidir1,2. Bir haşere kontrol ajanı olarak uygulama için, çok sayıda EPF’yi hastalıklı böceklerden veya doğal ortamdan izole etmek gerekir.
Bu organizmaların konaklarından örneklemesi, EPF’nin doğal konaklarda coğrafi dağılımını ve yaygınlık oranını anlamaya yardımcı olur3,4,5. Bununla birlikte, mantar enfekte böceklerin toplanması genellikle alandaki çevresel faktörler ve böcek popülasyonları ile sınırlıdır4. Böcek konakçılarının EPF enfeksiyonundan sonra öleceği ve daha sonra toprağa düşeceği göz önüne alındığında, EPF’nin toprak örneklerinden izole edilmesi istikrarlı bir kaynak olabilir3,6. Örneğin, saprofitlerin büyüme için kaynakları olarak ölü konağı kullandıkları bilinmektedir. Toprak yemi ve seçici orta sistemler, EPF’yi topraktan tespit etmek ve izole etmek için yaygın olarak kullanılmıştır3,4,7,8,9,10.
Seçici ortam yönteminde, seyreltilmiş toprak çözeltisi, bakterilerin büyümesini engellemek için geniş spektrumlu antibiyotikler (örneğin, kloramfenikol, tetrasiklin veya streptomisin) içeren bir ortama kaplanır2,3,9,11. Bununla birlikte, bu yöntemin türün çeşitliliğini ve yoğunluğunu bozabileceği ve birçok mikrobiyal topluluğun aşırı veya az tahmin edilmesine neden olabileceği bildirilmiştir6. Ayrıca, izole suşlar daha az patojeniktir ve izolasyon sırasında saprofitlerle rekabet eder. EPF’yi seyreltilmiş toprak çözeltisinden izole etmek zordur3. Seçici bir ortam kullanmak yerine, toprak yem yöntemi EPF’yi 2-3 hafta saklanabilen enfekte ölü böceklerden izole eder, böylece daha verimli ve standart bir EPF ayırma yöntemi sağlar3,4,7,6. Yöntemin kullanımı kolay olduğundan, çeşitli patojenik suşları düşük maliyetle izole edebilirsiniz4. Bu nedenle, birçok araştırmacı tarafından yaygın olarak kullanılmaktadır.
Farklı böcek yem sistemleri karşılaştırıldıktan sonra, Beauveria bassiana ve Metarhizium anisopliae, Hemiptera, Lepidoptera, Blattella ve Coleoptera6,12,13,14’e ait böceklerde bulunan en yaygın EPF türleridir. Bu böcek yemleri arasında, Galleria mellonella (Sipariş Lepidoptera) ve Tenebrio molitor (sipariş Coleoptera) beauveria ve Metarhizium spp. Bu nedenle, G. mellonella ve T. molitor genellikle böcek yemleme için kullanılır. Yıllar içinde, Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı (USDA) bir EPF Kütüphanesi (EPF kültürlerinin Tarımsal Araştırma Hizmeti Koleksiyonu, ARSEF) 4081 Beauveria spp., 18 Clonostachys spp., 878 Cordyceps spp., 2473 Metarhizium spp., 226 Purpureocillium spp. türü dahil olmak üzere çok çeşitli türler içerir. ve 13 Pochonia türü. Bir diğer EPF Kütüphanesi ise Amerika Birleşik Devletleri’ndeki Vermont Üniversitesi’nden Entomoloji Araştırma Laboratuvarı (ERL) tarafından 30 yıllığına inşa edilmiştir. Amerika Birleşik Devletleri, Avrupa, Asya, Afrika ve Orta Doğu16’dan 1345 EPF suşunu içerir.
Tayvan’daki yerel veya istila zararlılarını kontrol etmek için, yerli EPF’nin izolasyonu ve seçimi gereklidir. Bu nedenle, bu protokolde, toprak yem yönteminin prosedürünü değiştirdik ve tanımladık ve böcek yemi (yemek kurdu, Tenebrio molitor) sistemi ile birleştirdik17. Bu protokole dayanarak bir EPF kütüphanesi kuruldu. Ön EPF izolatları için iki tur tarama (aşılamanın nicelleştirilmesi) yapıldı. EPF izolatları böceklere patojeniklik gösterdi. Potansiyel suşlar morfolojik ve moleküler tanımlamalara tabi tutuldu ve termotolerans ve konidiyal üretim tahlilleri ile daha fazla analiz edildi. Ayrıca, etkili bir konidia sayısı (ECN) kavramı da önerildi. ECN formülü ve ana bileşen analizi (PCA) kullanılarak, potansiyel suşlar EPF kütüphanesinin kurulması ve taranmasının sürecini tamamlamak için simüle edilmiş çevresel basınç altında analiz edildi. Daha sonra, umut verici EPF suşlarının patojenitesi hedef haşere için test edildi (örneğin, Spodoptera litura). Mevcut protokol, termotolerans ve konidiyal üretim verilerini, EPF ile ilgili araştırmalar için standart bir sıralama sistemi olarak kullanılabilecek ECN formülüne ve PCA analizine entegre eder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Böcek kontrolü için entomopatojenik mantarlar (EPF) kullanılmıştır. EPF30,31,32’yi yalıtmak, seçmek ve tanımlamak için çeşitli yöntemler vardır. Farklı böcek yem yöntemlerini karşılaştıran Beauveria bassiana ve Metarhizium anisopliae genellikle böcek yemlerinde bulundu6,12,13,14.<sup c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı’ndan (MOST) Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 tarafından desteklendi.
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referências
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
