JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Biologia

Isolasjon og utvelgelse av entomopathogene sopp fra jordprøver og evaluering av sopp virulens mot

Published: September 28, 2021
doi:
10.3791/62882
, , , , , ,
1Department of Entomology,National Chung Hsing University, 2Department of Agricultural biology,Jeonbuk National University, 3Department of Agricultural Convergence Technology,Jeonbuk National University

Summary

Her presenterer vi en protokoll basert på måltidsorm (Tenebrio molitor)-agnsystem som ble brukt til å isolere og velge entomopathogene sopp (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel brukes til å velge høy stress tolerant EPF basert på fysiologiske egenskaper for mikrobiell kontroll i feltet.

Abstract

Entomopathogene sopp (EPF) er et av de mikrobielle kontrollmidlene for integrert skadedyrshåndtering. For å kontrollere lokale eller invasive, er det viktig å isolere og velge urfolk EPF. Derfor ble jordagnmetoden kombinert med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) -systemet brukt i denne studien med noen modifikasjoner. Den isolerte EPF ble deretter utsatt for virulenstesten mot landbruksskaden Spodoptera litura. Videre ble de potensielle EPF-stammene utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner. I tillegg ble conidiaproduksjonen og termototoleranseanalysen utført for de lovende EPF-stammene og sammenlignet; Disse dataene ble videre erstattet i formelen for effektivt conidia-nummer (ECN) for laboratorierangering. Jordagn-måltidsormsystemet og ECN-formelen kan forbedres ved å erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer for evaluering av kommersialisering og feltapplikasjon. Denne protokollen gir en rask og effektiv tilnærming for EPF-seleksjon og vil forbedre forskningen på biologiske kontrollmidler.

Introduction

For tiden er entomopathogene sopp (EPF) mye brukt i mikrobiell kontroll av landbruks-, skog- og hagebruk. Fordelene med EPF er dets brede vertsområder, god miljøtilpasning, miljøvennlig natur, og at den kan brukes med andre kjemikalier for å vise den synergistiske effekten for integrert skadedyrshåndtering1,2. For applikasjonen som skadedyrsbekjempelsesmiddel er det nødvendig å isolere et stort antall EPF fra enten syke insekter eller det naturlige miljøet.

Prøvetakingen av disse organismene fra vertene bidrar til å forstå den geografiske utbredelsen og prevalensen av EPF hos naturlige verter3,4,5. Imidlertid er samlingen av soppinfiserte insekter vanligvis begrenset av miljøfaktorer og insektpopulasjoner i feltet4. Tatt i betraktning at insektverter vil dø etter EPF-infeksjon og deretter falle i jorden, kan isolering av EPF fra jordprøver være en stabil ressurs3,6. For eksempel er saprofytter kjent for å bruke den døde verten som sin ressurs for vekst. Jordagn og selektive mediumsystemer har blitt mye brukt til å oppdage og isolere EPF fra jorda3,4,7,8,9,10.

I den selektive mediummetoden er den fortynnede jordløsningen belagt på et medium som inneholder bredspektret antibiotika (f.eks. kloramfenikol, tetracyklin eller streptomycin) for å hemme veksten av bakterier2,3,9,11. Det har imidlertid blitt rapportert at denne metoden kan forvrenge stammens mangfold og tetthet og kan forårsake en over- eller underestimering av mange mikrobielle samfunn6. Videre er de isolerte stammene mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolasjon. Det er vanskelig å isolere EPF fra den fortynnede jordløsningen3. I stedet for å bruke et selektivt medium, isolerer jordagnmetoden EPF fra de infiserte døde insekter, som kan lagres i 2-3 uker, og gir dermed en mer effektiv og standard EPF-separasjonsmetode3,4,7,6. Fordi metoden er enkel å betjene, kan man isolere en rekke patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det mye brukt av mange forskere.

Ved sammenligning av de forskjellige typer insektagnsystemer er Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae de vanligste EPF-artene som finnes i insekter som tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella og Coleoptera6,12,13,14. Blant disse insekt baits, Galleria mellonella (rekkefølge Lepidoptera) og Tenebrio molitor (orden Coleoptera) viser høyere utvinning rater av Beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor brukes G. mellonella og T. molitor ofte til insekt baiting. Gjennom årene har USAs landbruksdepartement (USDA) etablert et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection av EPF-kulturer, ARSEF) som inneholder et bredt utvalg av arter, inkludert 4081 arter av Beauveria spp., 18 arter av Clonostachys spp., 878 arter av Cordyceps spp., 2473 arter av Metarhizium spp., 226 arter av Purpureocillium spp., og 13 arter av Pochonia spp. blant andre15. Et annet EPF-bibliotek ble konstruert av Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det inkluderer 1345 stammer av EPF fra USA, Europa, Asia, Afrika og Midtøsten16.

For å kontrollere lokale eller invasjon i Taiwan, er det nødvendig med isolasjon og valg av urfolk EPF. Derfor, i denne protokollen, har vi modifisert og beskrevet prosedyren for jordagnmetoden og kombinert den med insektet agn (mealworm, Tenebrio molitor) system17. Basert på denne protokollen ble det opprettet et EPF-bibliotek. To runder med screening (kvantifisering av inokulering) ble utført for de foreløpige EPF-isolasjonene. EPF-isolasjoner viste patogenitet til insekter. De potensielle stammene ble utsatt for morfologiske og molekylære identifikasjoner og videre analysert av termototoleranse og konidial produksjonsanalyse. Videre ble det også foreslått et konsept med effektivt conidia-nummer (ECN). Ved hjelp av ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) ble de potensielle stammene analysert under simulert miljøtrykk for å fullføre prosessen med å etablere og screene EPF-biblioteket. Deretter ble patogenisitet av lovende EPF-stammer testet for målskade (f.eks. Spodoptera litura). Den nåværende protokollen integrerer termototoleranse og konidiale produksjonsdata i ECN-formelen og PCA-analysen, som kan brukes som et standard rangeringssystem for EPF-relatert forskning.

Protocol

MERK: Hele flytskjemaet vises i figur 1. 1. Isolasjon og utvalg av potensielle entomopathogene sopp (EPF) Samle jordprøven Fjern 1 cm av overflatejorden, og samle deretter jorda innenfor 5-10 cm dybde ved hjelp av en spade fra hvert prøvetakingssted.MERK: Prøvetakingssteder vil være et fjell, en skog eller tynt befolkede områder for å unngå forurensning av kunstig sprayede EPF-stammer. Sørg for at arealer til jordprøvene er dekket me…

Representative Results

Isolasjon og utvelgelse av potensielle Entomopathogenic sopp (EPF)Ved å bruke Tenebrio molitor-mediert Entomopathogenic sopp (EPF) bibliotek konstruksjonsmetode, ville antall sopp uten insekt-drepende aktivitet bli utelukket; Dermed kan isolasjonseffektiviteten og utvelgelsen av EPF i stor grad økes. Under anvendelsen av denne metoden ble det registrert informasjon om prøvetakingssteder, jordprøver og soppspredningsratene (tabell 2). Bas…

Discussion

Entomopathogene sopp (EPF) har blitt brukt til insektkontroll. Det finnes flere metoder for å isolere, velge og identifisere EPF30,31,32. Sammenligning av de forskjellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae ble ofte funnet i insekt baits6,12,13,14. …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne forskningen ble støttet av Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Vitenskaps- og teknologidepartementet (MOST).

Materials

Agar Bacteriological grade BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. AGR001 Suitable in most cell culture/molecular, biology applications.
AGAROSE, Biotechnology Grade BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. AGA001 For DNA electrophoresis.
BioGreen Safe DNA Gel Buffer BIOMAN SDB001T
Brass cork borer Dogger D89A-44001
Canon kiss x2 Canon EOS 450D For record strain colony morphology
Constant temperature incubator Yihder Co., Ltd. LE-509RD Fungal keeping.
cubee Mini-Centrifuge GeneReach MC-CUBEE
DigiGel 10 Digital Gel Image System TOPBIO DGIS-12S
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette Thermo Scientific 4642010
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette Thermo Scientific 4642030
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette Thermo Scientific 4642070
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette Thermo Scientific 4642090
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette Thermo Scientific 4642060
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette Thermo Scientific 4642080
GeneAmp PCR System 9700 Applied Biosystems 4342718
GenepHlow Gel/PCR Kit Geneaid DFH100
Genius Dry Bath Incubator Major Science MD-01N
Graduated Cylinder Custom A 100mL SIBATA SABP-1195906 Measure the volume of reagents.
Hand tally counter SDI NO.1055
Hemocytometer bioman AP-0650010 Calculate the number of spore
Inoculating loop Dogger D8GA-23000
lid IDEAHOUSE RS92004
Micro cover glass MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD 24241
Microscope imaging system SAGE VISION CO.,LTD SGHD-3.6C
Microscope Slides DOGGER DG75001-07105
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis ADVANCE AD110
Nikon optical microscope SAGE VISION CO.,LTD Eclipse CI-L
Plastic cup IDEAHOUSE CS60016
Presto Mini gDNA Yeast Kit Geneaid GYBY300 Fungal genomic DNA extraction kit
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) HiMedia Leading BioSciences Company M033 Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms.
Scalpel Blade No.23 Swann-Morton 310
Scalpel Handle No.4 AGARWAL SURGICALS SSS -FOR-01-91
Shovel Save & Safe A -1580242 -00
Silwet L-77 bioman(phytotech) S7777 Surfactant
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge Thermo Scientific 75002403
Steel Tweezers SIPEL ELECTRONIC SA GG-SA
Sterile Petri Dish BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. 1621 Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use.
ThermoCell MixingBlock BIOER MB-101
Tween 80 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 164-21775
TwinGuard ULT Freezer Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. MDF-DU302VX -80°C sample stored.
Vertical floor type cabinet Chih Chin BSC-3 Fungal operating culturing.
Vortex Genie II Scientific SIG560
Zipper storage bags Save & Safe A -1248915 -00
100 bp DNA Ladder Geneaid DL007
-20°C Freezer FRIGIDAIRE Frigidaire FFFU21M1QW -20°C sample and experimental reagents stored.
2X SuperRed PCR Master Mix TOOLS TE-SR01
50X TAE Buffer BIOMAN TAE501000
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
  2. Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
  3. Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
  4. Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
  5. Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
  6. Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
  7. Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
  8. Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
  9. Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
  10. Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
  11. Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
  12. Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
  13. Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
  14. Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
  15. Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
  16. Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
  17. Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
  18. Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
  19. Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
  20. Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
  21. Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
  22. . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
  23. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
  24. Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
  25. Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  26. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  27. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  28. Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
  29. Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
  30. Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
  31. Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
  32. Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
  33. Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
  34. Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
  35. Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
  36. Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
  37. Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
  38. Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
  39. Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
  40. Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
  41. Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
  42. Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
  43. Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
  44. Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
  45. Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).

Tags

Entomopathogenic FungiSoil SamplesInsect PestsIsolationVirulencePathogenicity ScreeningTenebrio MolitorSabouraud Dextrose AgarThermotoleranceConidia Production
check_url/pt/62882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Liu, Y., Ni, N., Chang, J., Li, Y., Lee, M. R., Kim, J. S., Nai, Y. Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests. J. Vis. Exp. (175), e62882, doi:10.3791/62882 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image