Her præsenterer vi en protokol baseret på melorme (Tenebrio molitor)-agn system, der blev brugt til at isolere og vælge entomopathogene svampe (EPF) fra jordprøver. En effektiv conidia nummer (ECN) formel bruges til at vælge høj stresstolerant EPF baseret på fysiologiske egenskaber for skadedyr mikrobiel kontrol i marken.
Entomopatogene svampe (EPF) er et af de mikrobielle kontrolmidler til integreret skadedyrsbekæmpelse. For at kontrollere lokale eller invasive skadedyr er det vigtigt at isolere og vælge indfødte EPF. Derfor blev jord agnmetoden kombineret med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system brugt i denne undersøgelse med nogle ændringer. Den isolerede EPF blev derefter underkastet virulenstesten mod landbrugs skadedyret Spodoptera litura. Desuden blev de potentielle EPF-stammer udsat for morfologiske og molekylære identifikationer. Desuden blev conidia-produktionen og termotoleranceanalysen udført for de lovende EPF-stammer og sammenlignet; disse data blev yderligere erstattet af formlen for effektivt conidianummer (ECN) for laboratorierangering. Jord agn-melorme system og ECN formel kan forbedres ved at erstatte insektarter og integrere flere stressfaktorer til evaluering af kommercialisering og anvendelse af marken. Denne protokol giver en hurtig og effektiv tilgang til EPF-udvælgelse og vil forbedre forskningen i biologiske kontrolmidler.
I øjeblikket er entomopatogene svampe (EPF) meget udbredt i den mikrobielle kontrol af landbrugs-, skov- og gartneri skadedyr. Fordelene ved EPF er dens brede udvalg, god miljømæssig tilpasningsevne, miljøvenlig natur, og at den kan bruges sammen med andre kemikalier for at vise den synergistiske effekt for integreret skadedyrsbekæmpelse1,2. Til påføring som skadedyrsbekæmpelsesmiddel er det nødvendigt at isolere et stort antal EPF fra enten syge insekter eller det naturlige miljø.
Prøveudtagningen af disse organismer fra deres værter hjælper med at forstå den geografiske fordeling og prævalens af EPF i naturlige værter3,4,5. Imidlertid er samlingen af svampeinficerede insekter normalt begrænset af miljømæssige faktorer og insektpopulationer i marken4. I betragtning af at insekt værter vil dø efter EPF-infektion og derefter falde i jorden, isolering af EPF fra jordprøver kan være en stabil ressource3,6. For eksempel er saprofitter kendt for at bruge den døde vært som deres ressource til vækst. Jord agn og selektive medium systemer er blevet meget brugt til at opdage og isolere EPF fra jorden3,4,7,8,9,10.
I den selektive mediummetode er den fortyndede jordopløsning belagt på et medium, der indeholder bredspektrede antibiotika (f.eks. chloramphenicol, tetracyklin eller streptomycin) for at hæmme væksten af bakterier2,3,9,11. Det er dog blevet rapporteret, at denne metode kan fordreje stammens mangfoldighed og tæthed og kan forårsage en over- eller undervurdering af mange mikrobielle samfund6. Desuden er de isolerede stammer mindre patogene og konkurrerer med saprofytter under isolation. Det er vanskeligt at isolere EPF fra den fortyndede jordopløsning3. I stedet for at bruge et selektivt medium isolerer jord agnmetoden EPF fra de inficerede døde insekter, som kan opbevares i 2-3 uger, hvilket giver en mere effektiv og standard EPF-adskillelsesmetode3,4,7,6. Fordi metoden er let at betjene, kan man isolere en række patogene stammer til en lav pris4. Derfor er det meget udbredt af mange forskere.
Ved sammenligning af de forskellige typer af insekt agn systemer, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae er de mest almindelige EPF arter, der findes i insekter, der tilhører Hemiptera, Lepidoptera, Blattella, og Coleoptera6,12,13,14. Blandt disse insekt lokkemad, Galleria mellonella (bestil Lepidoptera) og Tenebrio molitor (ordre Coleoptera) viser højere inddrivelse satser beauveria og Metarhizium spp., sammenlignet med andre insekter. Derfor er G. mellonella og T. molitor almindeligt anvendt til insekt baiting. I årenes løb har United States Department of Agriculture (USDA) etableret et EPF-bibliotek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), der indeholder en bred vifte af arter, herunder 4081 arter af Beauveria spp., 18 arter af Clonostachys spp., 878 arter af Cordyceps spp., 2473 arter af Metarhizium spp., 226 arter af Purpureocillium spp., og 13 arter af Pochonia spp. blandt andre15. Et andet EPF-bibliotek blev bygget af Entomology Research Laboratory (ERL) fra University of Vermont i USA i ca. 30 år. Det omfatter 1345 stammer af EPF fra USA, Europa, Asien, Afrika og Mellemøsten16.
For at kontrollere lokale eller invasion skadedyr i Taiwan, isolation og udvælgelse af indfødte EPF er påkrævet. Derfor har vi i denne protokol ændret og beskrevet proceduren for jordens agnmetode og kombineret den med insekt agn (melorme, Tenebrio molitor) system17. På grundlag af denne protokol blev der oprettet et EPF-bibliotek. Der blev udført to screeningsrunder (kvantificering af podning) for de foreløbige EPF-isolater. EPF-isolater viste sygdomsfremkaldende for insekter. De potentielle stammer blev udsat for morfologiske og molekylære identifikationer og yderligere analyseret af termotolerance og konidial produktion assay. Desuden blev der også foreslået et begreb om et effektivt conidianummer (ECN). Ved hjælp af ECN-formel og hovedkomponentanalyse (PCA) blev de potentielle stammer analyseret under simuleret miljøtryk for at fuldføre processen med at etablere og screene EPF-biblioteket. Efterfølgende blev patogenitet af lovende EPF-stammer testet for mål skadedyr (f.eks Spodoptera litura). Den nuværende protokol integrerer termotolerance- og konidiale produktionsdata i ECN-formlen og PCA-analysen, som kan bruges som standardrangeringssystem for EPF-relateret forskning.
Entomopatogene svampe (EPF) er blevet anvendt til insektbekæmpelse. Der er flere metoder til at isolere, vælge og identificere EPF30,31,32. Ved at sammenligne de forskellige typer insekt agn metoder, Beauveria bassiana og Metarhizium anisopliae var almindeligt forekommende i insekt lokkemad6,12,13,14.<sup …
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 fra Ministeriet for Videnskab og Teknologi (MOST).
Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
-20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |