Isolierung und Selektion entomopathogener Pilze aus Bodenproben und Bewertung der Pilzvirulenz gegen Schadinsekten
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das auf dem Mehlwurm (Tenebrio molitor) -Ködersystem basiert, das zur Isolierung und Auswahl entomopathogener Pilze (EPF) aus Bodenproben verwendet wurde. Eine effektive Konidienzahlformel (ECN) wird verwendet, um einen hoch stresstoleranten EPF basierend auf physiologischen Eigenschaften für die mikrobielle Schädlingsbekämpfung im Feld auszuwählen.
Abstract
Entomopathogene Pilze (EPF) sind eines der mikrobiellen Bekämpfungsmittel für den integrierten Pflanzenschutz. Um lokale oder invasive Schädlinge zu bekämpfen, ist es wichtig, einheimische EPF zu isolieren und auszuwählen. Daher wurde in dieser Studie die Bodenködermethode in Kombination mit dem Insektenködersystem (Mehlwurm, Tenebrio molitor) mit einigen Modifikationen verwendet. Die isolierten EPF wurden dann dem Virulenztest gegen den landwirtschaftlichen Schädling Spodoptera litura unterzogen. Darüber hinaus wurden die potenziellen EPF-Stämme morphologischen und molekularen Identifizierungen unterzogen. Darüber hinaus wurden die Konidienproduktion und der Thermotoleranztest für die vielversprechenden EPF-Stämme durchgeführt und verglichen; Diese Daten wurden weiter in die Formel der effektiven Konidienzahl (ECN) für das Laborranking substituiert. Das Bodenköder-Mehlwurm-System und die ECN-Formel können verbessert werden, indem Insektenarten ersetzt und mehr Stressfaktoren für die Bewertung der Kommerzialisierung und Feldanwendung integriert werden. Dieses Protokoll bietet einen schnellen und effizienten Ansatz für die EPF-Selektion und wird die Forschung an biologischen Bekämpfungsmitteln verbessern.
Introduction
Derzeit werden entomopathogene Pilze (EPF) häufig bei der mikrobiellen Bekämpfung von landwirtschaftlichen, forstwirtschaftlichen und gartenbaulichen Schädlingen eingesetzt. Die Vorteile von EPF sind seine große Wirtsbreite, gute Umweltanpassungsfähigkeit, umweltfreundliche Natur und dass es mit anderen Chemikalien verwendet werden kann, um den Synergieeffekt für den integrierten Pflanzenschutz zu zeigen1,2. Für die Anwendung als Schädlingsbekämpfungsmittel ist es notwendig, eine große Anzahl von EPF entweder aus erkrankten Insekten oder der natürlichen Umgebung zu isolieren.
Die Probenahme dieser Organismen von ihren Wirten hilft beim Verständnis der geografischen Verteilung und Prävalenzrate von EPF in natürlichen Wirten3,4,5. Die Sammlung von pilzinfizierten Insekten ist jedoch in der Regel durch Umweltfaktoren und Insektenpopulationen im Feld begrenzt4. In Anbetracht der Tatsache, dass Insektenwirte nach einer EPF-Infektion sterben und dann in den Boden fallen, könnte die Isolierung von EPF aus Bodenproben eine stabile Ressource sein3,6. Zum Beispiel sind Saprophyten dafür bekannt, den toten Wirt als ihre Ressource für das Wachstum zu nutzen. Die Bodenköder- und selektiven Mediumsysteme wurden häufig verwendet, um EPF aus dem Boden zu erkennen und zu isolieren3,4,7,8,9,10.
Bei der Methode des selektiven Mediums wird die verdünnte Bodenlösung auf ein Medium plattiert, das Breitbandantibiotika (z. B. Chloramphenicol, Tetracyclin oder Streptomycin) enthält, um das Wachstum von Bakterien zu hemmen2,3,9,11. Es wurde jedoch berichtet, dass diese Methode die Vielfalt und Dichte des Stammes verzerren und zu einer Über- oder Unterschätzung vieler mikrobieller Gemeinschaften führen kann6. Darüber hinaus sind die isolierten Stämme weniger pathogen und konkurrieren während der Isolierung mit Saprophyten. Es ist schwierig, EPF aus der verdünnten Bodenlösung zu isolieren3. Anstatt ein selektives Medium zu verwenden, isoliert die Bodenködermethode EPF von den infizierten toten Insekten, die für 2-3 Wochen gelagert werden können, wodurch eine effizientere und standardisierte EPF-Trennmethode3,4,7,6 bereitgestellt wird. Da die Methode einfach zu bedienen ist, kann man eine Vielzahl von pathogenen Stämmen zu geringen Kosten isolieren4. Daher ist es von vielen Forschern weit verbreitet.
Beim Vergleich der verschiedenen Arten von Insektenködersystemen sind Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae die häufigsten EPF-Arten, die in Insekten der Hemiptera, Lepidoptera, Blattella und Coleoptera gefunden werden6,12,13,14. Unter diesen Insektenködern zeigen Galleria mellonella (Ordnung Lepidoptera) und Tenebrio molitor (Ordnung Coleoptera) im Vergleich zu anderen Insekten höhere Erholungsraten von Beauveria und Metarhizium spp.. Daher werden G. mellonella und T. molitor häufig für Insektenköder verwendet. Im Laufe der Jahre hat das Landwirtschaftsministerium der Vereinigten Staaten (USDA) eine EPF-Bibliothek (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF) eingerichtet, die eine Vielzahl von Arten enthält, darunter 4081 Arten von Beauveria spp., 18 Arten von Clonostachys spp., 878 Arten von Cordyceps spp., 2473 Arten von Metarhizium spp., 226 Arten von Purpureocillium spp., und 13 Arten von Pochonia spp. unter anderem15. Eine weitere EPF-Bibliothek wurde vom Entomology Research Laboratory (ERL) der University of Vermont in den Vereinigten Staaten für ca. 30 Jahre gebaut. Es umfasst 1345 Stämme von EPF aus den Vereinigten Staaten, Europa, Asien, Afrika und dem Nahen Osten16.
Um lokale oder Invasionsschädlinge in Taiwan zu kontrollieren, ist die Isolierung und Auswahl der einheimischen EPF erforderlich. Daher haben wir in diesem Protokoll das Verfahren der Bodenködermethode modifiziert und beschrieben und mit dem Insektenködersystem (Mehlwurm, Tenebrio molitor) kombiniert17. Basierend auf diesem Protokoll wurde eine EPF-Bibliothek eingerichtet. Für die vorläufigen EPF-Isolate wurden zwei Screening-Runden (Quantifizierung der Impfung) durchgeführt. EPF-Isolate zeigten Pathogenität gegenüber Insekten. Die potenziellen Stämme wurden morphologischen und molekularen Identifizierungen unterzogen und durch den Thermotoleranz- und Konidialproduktionstest weiter analysiert. Darüber hinaus wurde auch ein Konzept der effektiven Konidienzahl (ECN) vorgeschlagen. Unter Verwendung der ECN-Formel und der Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurden die potenziellen Stämme unter simuliertem Umgebungsdruck analysiert, um den Prozess der Einrichtung und des Screenings der EPF-Bibliothek abzuschließen. Anschließend wurde die Pathogenität vielversprechender EPF-Stämme auf den Zielschädling (z.B. Spodoptera litura) getestet. Das aktuelle Protokoll integriert Thermotoleranz- und konidiale Produktionsdaten in die ECN-Formel und PCA-Analyse, die als Standard-Ranking-System für EPF-bezogene Forschung verwendet werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entomopathogene Pilze (EPF) wurden zur Insektenbekämpfung eingesetzt. Es gibt mehrere Methoden zum Isolieren, Auswählen und Identifizieren von EPF30,31,32. Im Vergleich der verschiedenen Arten von Insektenködermethoden wurden Beauveria bassiana und Metarhizium anisopliae häufig in Insektenködern gefunden6,12,13,14.</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch Grant 109-2313-B-005-048-MY3 des Ministeriums für Wissenschaft und Technologie (MOST) unterstützt.
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referências
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
