בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על מערכת פיתיון תולעי הארוחות (Tenebrio molitor) ששימשה לבידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות (EPF) מדגימות קרקע. נוסחת מספר קונידיה יעילה (ECN) משמשת לבחירת EPF עמיד בפני מתח גבוה המבוסס על מאפיינים פיזיולוגיים לבקרת מזיקים מיקרוביאלית בתחום.
Abstract
פטריות אנטומופתוגניות (EPF) הן אחד מסוכני הבקרה המיקרוביאלית לניהול מזיקים משולב. כדי לשלוט במזיקים מקומיים או פולשניים, חשוב לבודד ולבחור EPF ילידי. לכן, שיטת פיתיון הקרקע בשילוב עם פיתיון חרקים (תולעת ארוחה, מוליטור טנבריו) שימש במחקר זה עם כמה שינויים. EPF המבודד היה אז נתון לבדיקת virulence נגד המזיק החקלאי Spodoptera ליטורה. יתר על כן, זני EPF הפוטנציאליים היו נתונים לזיהויים מורפולוגיים ומולקולריים. בנוסף, ייצור קונידיה ובוח התרמוטולנס בוצעו עבור זני EPF מבטיחים והשוו; נתונים אלה הוחלפו עוד יותר בנוסחה של מספר קונידיה יעיל (ECN) לדירוג מעבדה. ניתן לשפר את מערכת תולעי הפיתיון בקרקע ואת נוסחת ECN על ידי החלפת מיני חרקים ושילוב גורמי לחץ נוספים להערכת מסחור ויישום שדה. פרוטוקול זה מספק גישה מהירה ויעילה לבחירת EPF וישפר את המחקר על סוכני בקרה ביולוגיים.
Introduction
כיום, פטריות אנטומופתוגניות (EPF) נמצאות בשימוש נרחב בשליטה מיקרוביאלית של מזיקים חקלאיים, יערות וגננות. היתרונות של EPF הם טווחי המארח הרחבים שלה, הסתגלות סביבתית טובה, טבע ידידותי לסביבה, וכי ניתן להשתמש בו עם כימיקלים אחרים כדי להראות את האפקט הסינרגיסטי לניהול מזיקים משולב1,2. עבור היישום כסוכן הדברה, יש צורך לבודד מספר גדול של EPF מחרקים חולים או מהסביבה הטבעית.
הדגימה של אורגניזמים אלה מן המארחים שלהם מסייעת בהבנת ההתפלגות הגיאוגרפית ואת שיעור השכיחות של EPF במארחים טבעיים3,4,5. עם זאת, אוסף החרקים הנגועים הפטרייתיים מוגבל בדרך כלל על ידי גורמים סביבתיים ואוכלוסיות חרקים בשטח4. בהתחשב בכך שמארחי חרקים ימותו לאחר זיהום EPF ואז ייפלו לאדמה, בידוד EPF מדגימות קרקע עשוי להיות משאב יציב3,6. לדוגמה, saprophytes ידועים להשתמש המארח המת כמשאב שלהם לצמיחה. פיתיון הקרקע ומערכות בינוניות סלקטיביות שימשו באופן נרחב כדי לזהות ולבודד EPF מהקרקע3,4,7,8,9,10.
בשיטה הבינונית הסלקטיבית, תמיסת הקרקע המדוללת מצופה על מדיום המכיל אנטיביוטיקה רחבת טווח (למשל, כלורמפניקול, טטרציקלין או סטרפטומיצין) כדי לעכב את צמיחת החיידקים2,3,9,11. עם זאת, דווח כי שיטה זו עלולה לעוות את המגוון והצפיפות של הזן ועלול לגרום להערכת יתר או תת-הערכה של קהילות מיקרוביות רבות6. יתר על כן, הזנים המבודדים הם פחות פתוגניים ומתחרים עם saprophytes במהלך הבידוד. קשה לבודד את EPF מפתרון הקרקע מדולל3. במקום להשתמש במדיום סלקטיבי, שיטת פיתיון הקרקע מבודדת את EPF מהחרקים המתים הנגועים, שניתן לאחסן במשך שבועיים-שלושה, ובכך מספקת שיטת הפרדת EPF יעילה וסטנדרטית יותר3,4,7,6. מכיוון שהשיטה קלה לתפעול, ניתן לבודד מגוון זנים פתוגניים בעלות נמוכה4. לכן, הוא נמצא בשימוש נרחב על ידי חוקרים רבים.
כאשר משווים בין הסוגים השונים של מערכות פיתיון חרקים, בובריה באסיאנה ו– Metarhizium anisopliae הם המינים הנפוצים ביותר של EPF הנמצאים בחרקים השייכים להמיפטרה, לפידופטרה, בלטלה וקולופטרה6,12,13,14. בין פיתיונות חרקים אלה, גלריה mellonella (סדר Lepidoptera) ו נמיריו מוליטור (סדר Coleoptera) להראות שיעורי התאוששות גבוהים יותר של בובריה ו Metarhizium spp., בהשוואה לחרקים אחרים. לכן, G. mellonella ו T. מוליטור משמשים בדרך כלל לפיתיון חרקים. במהלך השנים הקימה מחלקת החקלאות של ארצות הברית ספריית EPF (אוסף שירותי מחקר חקלאי של תרביות EPF, ARSEF) המכילה מגוון רחב של מינים, כולל 4081 מינים של בובריה spp., 18 מינים של Clonostachys spp., 878 מינים של קורדיספס spp., 2473 מינים של Metarhizium spp., 226 מינים של Purpureocillium spp., ו-13 מינים של פוצ’וניה, בין היתר15. ספריית EPF נוספת נבנתה על ידי המעבדה לחקר אנטומולוגיה (ERL) מאוניברסיטת ורמונט בארצות הברית במשך כ-30 שנה. הוא כולל 1345 זנים של EPF מארצות הברית, אירופה, אסיה, אפריקה והמזרח התיכון16.
כדי לשלוט במזיקים מקומיים או פלישה בטייוואן, בידוד ובחירה של EPF ילידים נדרש. לכן, בפרוטוקול זה, שינינו ותיארנו את ההליך של שיטת פיתיון הקרקע ושילבנו אותה עם מערכת פיתיון החרקים (תולעת הארוחה, מוליטור טנבריו) 17. בהתבסס על פרוטוקול זה, ספריית EPF הוקמה. שני סבבי הקרנה (כימות חיסון) בוצעו עבור בידוד EPF הראשוני. בידודי EPF הראו פתוגניות לחרקים. הזנים הפוטנציאליים היו נתונים לזיהויים מורפולוגיים ומולקולריים ונותחו עוד יותר על ידי בדיקת התרמו-סובלנות והייצור השובת. יתר על כן, הוצע גם מושג של מספר קונידיה יעיל (ECN). באמצעות נוסחת ECN וניתוח רכיבים עיקרי (PCA), הזנים הפוטנציאליים נותחו תחת לחץ סביבתי מדומה כדי להשלים את תהליך ההקמה וההקרנה של ספריית EPF. לאחר מכן, פתוגניות של זני EPF מבטיחים נבדקו עבור מזיק היעד (למשל, Spodoptera ליטורה). הפרוטוקול הנוכחי משלב נתוני תרמוטולרנס וייצור חמיתי בנוסחת ECN וניתוח PCA, אשר יכול לשמש כמערכת דירוג סטנדרטית למחקר הקשור ל- EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
פטריות אנטומופתוגניות (EPF) שימשו לבקרת חרקים. קיימות מספר שיטות לבידוד, בחירה וזיהוי של EPF30,31,32. בהשוואה בין הסוגים השונים של שיטות פיתיון חרקים, בובריה באסיאנה ו Metarhizium אניסופליה נמצאו בדרך כלל פיתיונים חרקים6,12,13,14.<su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי גרנט 109-2313-B-005-048 -MY3 ממשרד המדע והטכנולוגיה (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referências
- Wraight, S. P., Carruthers, R. I. . Biopesticides: use and Delivery. , 233-269 (1999).
- Chase, A., Osborne, L., Ferguson, V. Selective isolation of the entomopathogenic fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae from an artificial potting medium. Florida Entomologist. , 285-292 (1986).
- Meyling, N. V. Methods for isolation of entomopathogenic fungi from the soil environment. University of Copenhagen. , 1-18 (2007).
- Zimmermann, G. The ‘Galleria bait method’for detection of entomopathogenic fungi in soil. Journal of applied Entomology. 102 (1-5), 213-215 (1986).
- Schneider, S., Widmer, F., Jacot, K., Kölliker, R., Enkerli, J. Spatial distribution of Metarhizium clade 1 in agricultural landscapes with arable land and different semi-natural habitats. Applied Soil Ecology. 52, 20-28 (2012).
- Hallouti, A., et al. Diversity of entomopathogenic fungi associated with Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae)) in Moroccan Argan forests and nearby area: impact of soil factors on their distribution. BMC Ecology. 20 (1), 1-13 (2020).
- Meyling, N. V., Eilenberg, J. Occurrence and distribution of soil borne entomopathogenic fungi within a single organic agroecosystem. Agriculture, Ecosystems and Environment. 113 (1-4), 336-341 (2006).
- Skalický, A., Bohatá, A., Šimková, J., Osborne, L. S., Landa, Z. Selection of indigenous isolates of entomopathogenic soil fungus Metarhizium anisopliae under laboratory conditions. Folia Microbiologica. 59 (4), 269-276 (2014).
- Veen, K., Ferron, P. A selective medium for the isolation of Beauveria tenella and of Metarrhizium anisopliae. Journal of Invertebrate Pathology. 8 (2), 268-269 (1966).
- Goettel, M., Inglis, D., Lacy, L. . Manual of Techniques in Insect Pathology. , 213-249 (1997).
- Luz, C., Netto, M. C. B., Rocha, L. F. N. In vitro susceptibility to fungicides by invertebrate-pathogenic and saprobic fungi. Mycopathologia. 164 (1), 39-47 (2007).
- Mantzoukas, S., et al. Trapping entomopathogenic fungi from vine terroir soil samples with insect baits for controlling serious pests. Applied Sciences. 10 (10), 3539 (2020).
- Goble, T., Dames, J., Hill, M., Moore, S. The effects of farming system, habitat type and bait type on the isolation of entomopathogenic fungi from citrus soils in the Eastern Cape Province, South Africa. BioControl. 55 (3), 399-412 (2010).
- Nishi, O., Iiyama, K., Yasunaga-Aoki, C., Shimizu, S. Isolation of entomopathogenic fungi from soil by using bait method with termite, Reticulitermes speratus. Enotomotech. 35, 21-26 (2011).
- Castrillo, L. . ARS Collection of Entomopathogenic Fungal Cultures (ARSEF). , (2014).
- Kim, J. C., et al. Tenebrio molitor-mediated entomopathogenic fungal library construction for pest management. Journal of Asia-Pacific Entomology. 21 (1), 196-204 (2018).
- Keyser, C. A., Henrik, H., Steinwender, B. M., Meyling, N. V. Diversity within the entomopathogenic fungal species Metarhizium flavoviride associated with agricultural crops in Denmark. BMC Microbiology. 15 (1), 1-11 (2015).
- Quesada-Moraga, E., Navas-Cortés, J. A., Maranhao, E. A., Ortiz-Urquiza, A., Santiago-Álvarez, C. Factors affecting the occurrence and distribution of entomopathogenic fungi in natural and cultivated soils. Mycological Research. 111 (8), 947-966 (2007).
- Park, J. B., et al. Developmental characteristics of Tenebrio molitor larvae (Coleoptera: Tenebrionidae) in different instars. International Journal of Industrial Entomology. 28 (1), 5-9 (2014).
- Chang, J. -. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Frontiers in Sustainable Food Systems. 5, 15 (2021).
- Podder, D., Ghosh, S. K. A new application of Trichoderma asperellum as an anopheline larvicide for eco friendly management in medical science. Scientific reports. 9 (1), 1-15 (2019).
- . Geneaid Biotech Ltd. Presto Mini gDNA Yeast, Ver. 04.27.17 Available from: https://www.geneaid.com/data/files/1605664221308055331.pdf (2021)
- White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR protocols: A guide to methods and applications. 18 (1), 315-322 (1990).
- Kepler, R. M., Humber, R. A., Bischoff, J. F., Rehner, S. A. Clarification of generic and species boundaries for Metarhizium and related fungi through multigene phylogenetics. Mycologia. 106 (4), 811-829 (2014).
- Kepler, R. M. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
- Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
- Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
- Herlinda, S., Mulyati, S. I. Selection of isolates of entomopathogenic fungi and the bioefficacy of their liquid production against Leptocorisa oratorius nymphs. Microbiology Indonesia. 2 (3), 9 (2008).
- Herlinda, S., Irsan, C., Mayasari, R., Septariani, S. Identification and selection of entomopathogenic fungi as biocontrol agents for Aphis gossypii from South Sumatra. Microbiology Indonesia. 4 (3), 137-142 (2010).
- Montes-Bazurto, L. G., Peteche-Yonda, Y., Medina-Cardenas, H. C., Bustillo-Pardey, A. E. Selection of entomopathogenic fungi for the biological control of Demotispa neivai (Coleoptera: Chrysomelidae) in oil palm plantations in Colombia. Journal of Entomological Science. 55 (3), 388-404 (2020).
- Shin, T. -. Y., Choi, J. -. B., Bae, S. -. M., Koo, H. -. N., Woo, S. -. D. Study on selective media for isolation of entomopathogenic fungi. International Journal of Industrial Entomology. 20 (1), 7-12 (2010).
- Sharma, L., Oliveira, I., Torres, L., Marques, G. Entomopathogenic fungi in Portuguese vineyards soils: Suggesting a ‘Galleria-Tenebrio-bait method’as bait-insects Galleria and Tenebrio significantly underestimate the respective recoveries of Metarhizium (robertsii) and Beauveria (bassiana). MycoKeys. (38), 1 (2018).
- Rodríguez, M., Gerding, M., France, A. Selección de Hongos Entomopatógenos para el Control de Varroa destructor (Acari: Varroidae). Chilean journal of agricultural research. 69 (4), 534-540 (2009).
- Yang, H., et al. Persistence of Metarhizium (Hypocreales: Clavicipitaceae) and Beauveria bassiana (Hypocreales: Clavicipitaceae) in tobacco soils and potential as biocontrol agents of Spodoptera litura (Lepidoptera: Noctuidae). Environmental entomology. 48 (1), 147-155 (2019).
- Muñiz-Reyes, E., Guzmán-Franco, A. W., Sánchez-Escudero, J., Nieto-Angel, R. Occurrence of entomopathogenic fungi in tejocote (C rataegus mexicana) orchard soils and their pathogenicity against R hagoletis pomonella. Journal of Applied Microbiology. 117 (5), 1450-1462 (2014).
- Lacey, L. A., et al. Goettel Insect pathogens as biological control agents: Back to the future. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 1-41 (2015).
- Humber, R. A. . Manual of techniques in insect pathology. , 153-185 (1997).
- Rehner, S. A., Buckley, E. A Beauveria phylogeny inferred from nuclear ITS and EF1-α sequences: evidence for cryptic diversification and links to Cordyceps teleomorphs. Mycologia. 97 (1), 84-98 (2005).
- Quandt, C. A., et al. Phylogenetic-based nomenclatural proposals for Ophiocordycipitaceae (Hypocreales) with new combinations in Tolypocladium. IMA fungus. 5 (1), 121-134 (2014).
- Shah, F. A., Wang, C. S., Butt, T. M. Nutrition influences growth and virulence of the insect-pathogenic fungus Metarhizium anisopliae. FEMS Microbiology Letters. 251 (2), 259-266 (2005).
- Ignoffo, C. Environmental factors affecting persistence of entomopathogens. Florida Entomologist. , 516-525 (1992).
- Rodrigues, I. W., Forim, M., Da Silva, M., Fernandes, J., Batista Filho, A. Effect of ultraviolet radiation on fungi Beauveria bassiana and Metarhizium anisopliae, pure and encapsulated, and bio-insecticide action on Diatraea saccharalis. Advances in Entomology. 4 (3), 151-162 (2016).
- Paula, A. R., Ribeiro, A., Lemos, F. J. A., Silva, C. P., Samuels, R. I. Neem oil increases the persistence of the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae for the control of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) larvae. Parasites and Vectors. 12 (1), 1-9 (2019).
- Morley-Davies, J., Moore, D., Prior, C. Screening of Metarhizium and Beauveria spp. conidia with exposure to simulated sunlight and a range of temperatures. Mycological Research. 100 (1), 31-38 (1996).
- Rangel, D. E., Braga, G. U., Flint, S. D., Anderson, A. J., Roberts, D. W. Variations in UV-B tolerance and germination speed of Metarhizium anisopliae conidia produced on insects and artificial substrates. Journal of Invertebrate Pathology. 87 (2-3), 77-83 (2004).
