土壌サンプルからの病原性真菌の単離と選択と昆虫害虫に対する真菌性毒性の評価
Summary
ここでは、土壌サンプルから病原性真菌(EPF)を単離・選択するために用いたミミズ(テネブリオモリター)-ベイトシステムに基づくプロトコルを提示する。有効なコニディア数(ECN)式は、現場での害虫微生物制御のための生理学的特性に基づいて高い耐ストレスEPFを選択するために使用される。
Abstract
病原性真菌(EPF)は、一体化した害虫管理のための微生物制御剤の1つである。局所的または侵襲的な害虫を制御するには、先住民族のEPFを分離して選択することが重要です。そこで、この土壌餌法と昆虫餌(ミミズ、 テネブリオモリター)システムを組み合わせて、いくつかの修正を行った。その後、単離されたEPFは、農業害虫 スポドプテラリトゥラに対する毒性試験を受けた。さらに、電位EPF株は形態学的および分子同定を行った。さらに、コニディア生産および耐熱性アッセイを有望なEPF株に対して行い、比較した。これらのデータは、実験室の順位付けに有効なコニディア数(ECN)の式にさらに置換された。土壌餌-ミミズシステムとECN式は、昆虫種を置き換え、商業化とフィールドアプリケーションの評価のためのより多くのストレス要因を統合することによって改善することができます。このプロトコルは、EPF選択のための迅速かつ効率的なアプローチを提供し、生物学的制御剤の研究を改善します。
Introduction
現在、エントモ病原性真菌(EPF)は、農業、森林、園芸害虫の微生物管理に広く使用されています。EPFの利点は、その広い宿主範囲、良好な環境適応性、環境に優しい性質、および統合された害虫管理のための相乗効果を示すために他の化学物質と使用することができる1,2です。害虫防除剤としての適用のためには、病気の昆虫または自然環境のいずれかから多数のEPFを単離する必要がある。
これらの生物をホストからサンプリングすることは、自然なホスト3,4,5におけるEPFの地理的分布と有病率を理解するのに役立ちます。しかし、真菌感染昆虫の収集は、通常、フィールド4の環境要因および昆虫集団によって制限される。昆虫宿主がEPF感染後に死んで土壌に落ちることを考えると、土壌サンプルからのEPFの単離は安定した資源である可能性があります3,6。例えば、窒息物は、成長のためのそれらのリソースとして死んだ宿主を使用することが知られている。土壌餌および選択的培地システムは、土壌からEPFを検出し、分離するために広く使用されています3,4,7,8,9,10.
選択的培地法では、希釈された土壌溶液を広域スペクトル抗生物質(例えば、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン)を含む培地にメッキされ、細菌2、3、9、11の増殖を阻害する。しかし、この方法は株の多様性と密度を歪め、多くの微生物群集の過大評価または過小推定を引き起こす可能性があると報告されています6。さらに、単離株は病原性が低く、単離中に窒息死と競合する。希釈土液3からEPFを分離することは困難である。選択的培地を使用する代わりに、土壌ベイト法は、感染した死んだ昆虫からEPFを分離し、2〜3週間保存することができ、それによってより効率的で標準的なEPF分離方法3、4、7、6を提供する。この方法は操作が容易であるため、種々の病原性株を低コスト4で単離することができる。そのため、多くの研究者に広く使用されています。
異なる種類の昆虫餌システムを比較すると、ボーベリアバシアナとメタリジウムアニソピアは、ヘミプテラ、レピドプテラ、ブラッテラ、コレオプテラ6、12、13,14に属する昆虫に見られる最も一般的なEPF種です。これらの昆虫の餌の中で、ガレリアメロネラ(順序レピドプテラ)とテネブリオモリター(オーダーコレオプテラ)は、他の昆虫と比較すると、ボーベリアとメタリジウムsppのより高い回復率を示す。そのため、G. メロネラと T. モリターは、昆虫の餌付けに一般的に使用されます。長年にわたり、 米国農務省(USDA)は、4081種のボーベリア属、18種のクロノスタチ属、878種のコダイセプス属、2473種のメタフイジウムspp.,226種を含む多種多様な種を含むEPF図書館(EPF培養物の農業研究サービスコレクション、ARSEF)を設立しました。 他の15の間でポチョニア属の13種。もう一つのEPF図書館は、米国バーモント大学から昆虫学研究所(ERL)によって30年間建設されました。米国、ヨーロッパ、アジア、アフリカ、中東16からのEPFの1345株が含まれています。
台湾の局所的または侵略的な害虫を制御するには、先住民族EPFの隔離と選択が必要です。したがって、このプロトコルでは、土壌餌法の手順を修正して説明し、昆虫餌(ミミズ、 テネブリモリター)system17と組み合わせました。このプロトコルに基づいて、EPF ライブラリが確立されました。予備EPF分離物に対して2ラウンドのスクリーニング(接種の定量化)を行った。EPF分離株は昆虫に対する病原性を示した。潜在的株は形態学的および分子同定を行い、さらに熱寛容および円錐形生産アッセイによって分析された。また、有効なコニディア数(ECN)の概念も提案された。ECN式と主成分分析(PCA)を用いて、EPFライブラリの確立とスクリーニングのプロセスを完了するために、環境圧力のシミュレーション下で潜在的な歪を分析した。続いて、有望なEPF株の病原性を標的害虫(例えば 、スポドプテラリトゥラ)について試験した。現在のプロトコルは、ECNの式とPCA分析に熱寛容と同音量の生産データを統合し、EPF関連研究のための標準のランキングシステムとして使用することができます。
Protocol
注: 図 1 にフローチャート全体を示します。 1. 潜在的な病原性真菌(EPF)の分離と選択 土壌サンプルを収集する 表面の土の1cmを取り除き、各サンプリング部位からシャベルを使用して5〜10cmの深さの中の土を集めます。注:サンプリングサイトは、人工的に散布されたEPF株の汚染を避けるために、山、森林、またはまばらな人口の領域?…
Representative Results
潜在的な病原性真菌(EPF)の単離と選択テネブリオモリトリオ介在性エントモ病原性真菌(EPF)ライブラリ構築法を用いることで、昆虫殺し活性のない真菌の数は除外される。したがって、EPFの絶縁効率と選択が大幅に向上する可能性があります。この方法の適用中に、サンプリング部位の情報、土壌サンプル、および真菌発芽率を記録した(?…
Discussion
昆虫防除にはエントモ病原性真菌(EPF)が用いられている。EPF30,31,32 を分離、選択、識別する方法はいくつかあります。異なる種類の昆虫餌法を比較すると、ボーベリアバシアナとメタリジウムアニソピアは、昆虫の餌6,12,13,14<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、科学技術省(MOST)のグラント109-2313-B-005-005-048-MY3によって支援されました。
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
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Citar este artigo
Liu, Y., Ni, N., Chang, J., Li, Y., Lee, M. R., Kim, J. S., Nai, Y. Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests. J. Vis. Exp. (175), e62882, doi:10.3791/62882 (2021).