Isolamento e Seleção de Fungos Entomopatômicos de Amostras de Solo e Avaliação da Virulência Fúngica contra Pragas de Insetos
Summary
Aqui apresentamos um protocolo baseado no sistema de isca mealworm (Tenebrio molitor)-isca que foi utilizado para isolar e selecionar fungos entomopatômicos (EPF) a partir de amostras de solo. Uma fórmula eficaz de número de conidia (ECN) é usada para selecionar EPF tolerante ao alto estresse com base em características fisiológicas para controle microbiano de pragas no campo.
Abstract
Os fungos entomopatômicos (EPF) são um dos agentes de controle microbiano para o manejo integrado de pragas. Para controlar pragas locais ou invasivas, é importante isolar e selecionar ePF indígena. Por isso, o método de isca de solo combinado com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor) foi utilizado neste estudo com algumas modificações. Os EPF isolados foram então submetidos ao teste de virulência contra a praga agrícola Spodoptera litura. Além disso, as cepas potenciais de EPF foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares. Além disso, foram realizados ensaios de produção conidia e termotolerância para as promissoras cepas de EPF e comparadas; esses dados foram substituídos ainda na fórmula do número efetivo de conidia (ECN) para classificação laboratorial. O sistema de isca-míope do solo e a fórmula ECN podem ser melhorados substituindo espécies de insetos e integrando mais fatores de estresse para a avaliação da comercialização e aplicação do campo. Este protocolo fornece uma abordagem rápida e eficiente para a seleção da EPF e melhorará a pesquisa sobre agentes de controle biológico.
Introduction
Atualmente, os fungos entomopatômicos (EPF) são amplamente utilizados no controle microbiano de pragas agrícolas, florestais e horticulturais. As vantagens do EPF são suas amplas faixas de hospedagem, boa adaptabilidade ambiental, natureza ecológica, e que pode ser usada com outros produtos químicos para mostrar o efeito sinérgico para o manejo integrado de pragas1,2. Para a aplicação como agente de controle de pragas, é necessário isolar um grande número de EPF de insetos doentes ou do ambiente natural.
A amostragem desses organismos de seus hospedeiros ajuda na compreensão da distribuição geográfica e da prevalência da EPF em hospedeiros naturais3,4,5. No entanto, a coleta de insetos infectados fúngicos são geralmente limitadas por fatores ambientais e populações de insetos no campo4. Considerando que os hospedeiros de insetos morrerão após a infecção pelo EPF e, em seguida, cairão no solo, o isolamento do EPF das amostras do solo pode ser um recurso estável3,6. Por exemplo, saprophytes são conhecidos por usar o hospedeiro morto como seu recurso para o crescimento. A isca do solo e os sistemas médios seletivos têm sido amplamente utilizados para detectar e isolar o EPF do solo3,4,7,8,9,10.
No método médio seletivo, a solução de solo diluído é banhada em um meio contendo antibióticos de amplo espectro (por exemplo, clorofenicol, tetraciclina ou estreptomicina) para inibir o crescimento de bactérias2,3,9,11. No entanto, foi relatado que esse método pode distorcer a diversidade e densidade da cepa e pode causar uma super ou subestimação de muitas comunidades microbianas6. Além disso, as cepas isoladas são menos patogênicas e competem com saprofitos durante o isolamento. É difícil isolar a EPF da solução de solo diluída3. Em vez de usar um meio seletivo, o método de isca do solo isola o EPF dos insetos mortos infectados, que podem ser armazenados por 2-3 semanas, fornecendo assim um método de separação EPF mais eficiente e padrão3,4,7,6. Como o método é fácil de operar, pode-se isolar uma variedade de cepas patogênicas a um baixo custo4. Portanto, é amplamente utilizado por muitos pesquisadores.
Ao comparar os diferentes tipos de sistemas de isca de insetos, Beauveria bassiana e Metarhizium anisopliae são as espécies EPF mais comuns que são encontradas em insetos pertencentes à Hemiptera, Lepidoptera, Blattella e Coleoptera6,12,13,14. Entre essas iscas de insetos, Galleria mellonella (ordem Lepidoptera) e Tenebrio molitor (ordem Coleoptera) mostram maiores taxas de recuperação de Beauveria e Metarhizium spp., quando comparados com outros insetos. Portanto, G. mellonella e T. molitor são comumente usados para isca de insetos. Ao longo dos anos, o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) estabeleceu uma Biblioteca EPF (Coleção de Serviços de Pesquisa Agrícola de culturas EPF, ARSEF) que contém uma grande variedade de espécies, incluindo 4081 espécies de Beauveria spp., 18 espécies de Clonostachys spp., 878 espécies de Cordyceps spp., 2473 espécies de Metarhizium spp., 226 espécies de Purpureocillium spp., e 13 espécies de Pochonia spp. entre outras15. Outra Biblioteca EPF foi construída pelo Laboratório de Pesquisa em Entomologia (ERL) da Universidade de Vermont, nos Estados Unidos, por 30 anos. Inclui 1345 cepas de EPF dos Estados Unidos, Europa, Ásia, África e Oriente Médio16.
Para controlar pragas locais ou de invasão em Taiwan, é necessário o isolamento e a seleção de EPF indígenas. Portanto, neste protocolo, modificamos e descrevemos o procedimento do método de isca do solo e o combinamos com o sistema isca de inseto (minhoca, Tenebrio molitor)17. Com base neste protocolo, foi criada uma biblioteca da EPF. Foram realizadas duas rodadas de triagem (quantificação da inoculação) para os isolados preliminares da EPF. Os isolados do EPF apresentaram patogenicidade aos insetos. As cepas potenciais foram submetidas a identificações morfológicas e moleculares e posteriormente analisadas pelo ensaio termotolerância e produção conidial. Além disso, também foi proposto um conceito de número de conidia eficaz (ECN). Utilizando a fórmula ECN e a análise de componentes principais (PCA), as cepas potenciais foram analisadas sob pressão ambiental simulada para concluir o processo de criação e triagem da biblioteca do EPF. Posteriormente, foram testadas patogenicidades de cepas promissoras de EPF para a praga alvo (por exemplo, Spodoptera litura). O protocolo atual integra dados de termotolerância e produção conidial na fórmula ECN e análise pca, que podem ser utilizados como um sistema de classificação padrão para pesquisas relacionadas ao EPF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fungos entomopatômicos (EPF) têm sido usados para o controle de insetos. Existem vários métodos para isolar, selecionar e identificar EPF30,31,32. Comparando os diferentes tipos de métodos de isca de insetos, a anisopliae Beauveria bassiana e Metarhizium foram comumente encontradas em iscas de insetos6,12,13,14.<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 do Ministério da Ciência e Tecnologia (MOST).
Materials
| Agar Bacteriological grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGR001 | Suitable in most cell culture/molecular, biology applications. |
| AGAROSE, Biotechnology Grade | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | AGA001 | For DNA electrophoresis. |
| BioGreen Safe DNA Gel Buffer | BIOMAN | SDB001T | |
| Brass cork borer | Dogger | D89A-44001 | |
| Canon kiss x2 | Canon | EOS 450D | For record strain colony morphology |
| Constant temperature incubator | Yihder Co., Ltd. | LE-509RD | Fungal keeping. |
| cubee Mini-Centrifuge | GeneReach | MC-CUBEE | |
| DigiGel 10 Digital Gel Image System | TOPBIO | DGIS-12S | |
| Finnpipette F2 0.2 to 2 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642010 | |
| Finnpipette F2 1 to 10 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642030 | |
| Finnpipette F2 10 to 100 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642070 | |
| Finnpipette F2 100 to 1000 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642090 | |
| Finnpipette F2 2 to 20 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642060 | |
| Finnpipette F2 20 to 200 µL Pipette | Thermo Scientific | 4642080 | |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | 4342718 | |
| GenepHlow Gel/PCR Kit | Geneaid | DFH100 | |
| Genius Dry Bath Incubator | Major Science | MD-01N | |
| Graduated Cylinder Custom A 100mL | SIBATA | SABP-1195906 | Measure the volume of reagents. |
| Hand tally counter | SDI | NO.1055 | |
| Hemocytometer | bioman | AP-0650010 | Calculate the number of spore |
| Inoculating loop | Dogger | D8GA-23000 | |
| lid | IDEAHOUSE | RS92004 | |
| Micro cover glass | MUTO PURE CHEMICALS CO.,LTD | 24241 | |
| Microscope imaging system | SAGE VISION CO.,LTD | SGHD-3.6C | |
| Microscope Slides | DOGGER | DG75001-07105 | |
| Mupid-2plus DNA Gel Electrophoresis | ADVANCE | AD110 | |
| Nikon optical microscope | SAGE VISION CO.,LTD | Eclipse CI-L | |
| Plastic cup | IDEAHOUSE | CS60016 | |
| Presto Mini gDNA Yeast Kit | Geneaid | GYBY300 | Fungal genomic DNA extraction kit |
| Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium) | HiMedia Leading BioSciences Company | M033 | Used for cultivation of yeasts, moulds and aciduric microorganisms. |
| Scalpel Blade No.23 | Swann-Morton | 310 | |
| Scalpel Handle No.4 | AGARWAL SURGICALS | SSS -FOR-01-91 | |
| Shovel | Save & Safe | A -1580242 -00 | |
| Silwet L-77 | bioman(phytotech) | S7777 | Surfactant |
| Sorvall Legend Micro 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002403 | |
| Steel Tweezers | SIPEL ELECTRONIC SA | GG-SA | |
| Sterile Petri Dish | BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd. | 1621 | Shallow cylindrical containers with fitted lids, specifically for microbiology or cell culture use. |
| ThermoCell MixingBlock | BIOER | MB-101 | |
| Tween 80 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 164-21775 | |
| TwinGuard ULT Freezer | Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd. | MDF-DU302VX | -80°C sample stored. |
| Vertical floor type cabinet | Chih Chin | BSC-3 | Fungal operating culturing. |
| Vortex Genie II | Scientific | SIG560 | |
| Zipper storage bags | Save & Safe | A -1248915 -00 | |
| 100 bp DNA Ladder | Geneaid | DL007 | |
| -20°C Freezer | FRIGIDAIRE | Frigidaire FFFU21M1QW | -20°C sample and experimental reagents stored. |
| 2X SuperRed PCR Master Mix | TOOLS | TE-SR01 | |
| 50X TAE Buffer | BIOMAN | TAE501000 |
Referências
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