ヒト細胞中の内因性リン酸化STATタンパク質の測定のための時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動アッセイ
Summary
時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動細胞ベースのアッセイプロトコルは、384ウェルフォーマットの細胞溶解物中の内因性リン酸化シグナルトランスデューサおよび転写活性化剤(STAT)1/3/4/5/6タンパク質の単純、特異的、高感度、および堅牢な定量のために記載されています。
Abstract
ヤヌスキナーゼ(JAK)/シグナルトランスデューサーおよび転写の活性化因子(STAT)シグナル伝達経路は、サイトカインおよび成長因子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしている。STATタンパク質は、主にJAKによって媒介されるチロシンリン酸化によって活性化される。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している。したがって、天然細胞シグナル伝達環境内でのSTATタンパク質のリン酸化をモニターする能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。リン酸化STATタンパク質を定量するために利用可能な従来のアッセイ形式には、ウェスタンブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)が含まれる。これらの異種の方法は、労働集約的でスループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、信頼性が低い(特異的な)ことがよくあります。均質な(洗浄なしの)方法が利用可能であるが、依然として高価である。
ここでは、新規サンダー時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動(TR-FRET)プラットフォームを使用して、接着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の内因性レベルの384ウェルフォーマットで、高感度で堅牢で費用対効果の高い測定のための詳細なプロトコルが提供されています。細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、ハイスループットスクリーニング(HTS)用に設計されています。アッセイプロトコルは柔軟で、少量サンプル(15 μL)を使用し、1つの試薬添加ステップのみを必要とし、低スループットおよびハイスループットのアプリケーションに適合させることができます。各ホスホ-STATサンドイッチイムノアッセイは、既知のアゴニストおよび阻害剤を用いて最適化された条件下で検証され、予想される薬理学およびZ’因子値を生成する。TR-FRETアッセイはレシオメトリックであり、洗浄ステップを必要としないため、従来のアプローチよりもはるかに優れた再現性を提供します。この一連のアッセイは、細胞処理後の特異的リン酸化STATタンパク質のより包括的な分析、およびJAK/STATシグナル伝達経路の特異的および選択的モジュレーターのスクリーニングおよび特性評価のための新しい費用対効果の高いツールを提供します。
Introduction
JAK/STATシグナル伝達経路は、多様なサイトカイン、インターフェロン、成長因子、および関連分子に対する細胞応答を媒介する上で重要な役割を果たしています1,2。これらのリガンドの特異的細胞表面受容体への結合はJAKの活性化をもたらし、JAKは特定のチロシン残基のリン酸化によってSTATタンパク質を活性化する。STATリン酸化は、それらの二量体化および核への転座をもたらし、そこで調節された標的遺伝子の転写にその効果を発揮する。STAT ファミリは、STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b、および STAT6 の 7 つのメンバーで構成されています。メンバーは、増殖、分化、アポトーシス、血管新生、および免疫系調節を含む生理学的細胞プロセスの調節において複雑かつ不可欠な役割を果たす。STATシグナル伝達経路の異常な活性化は、多くのヒト疾患、特に癌および免疫関連状態に関与している3,4。したがって、天然細胞シグナル伝達環境におけるSTATタンパク質のリン酸化を評価する能力は、学術的および創薬的研究の両方にとって重要である。
今日まで、STATを含む細胞内リン酸化タンパク質レベルを測定するために使用される従来の方法は、抗体ベースであり、ウェスタンブロッティング、ELISA、およびホスホフローサイトメトリーを含む。これらの異種の方法は、労力がかかり、時間がかかり、エラーが発生しやすく、スループットが低く、ウェスタンブロッティングの場合、しばしば信頼性が低い(特異性の問題など)5。対照的に、均質アッセイは、より少ない実験ステップを必要とし、より少ないサンプル量を使用し、HTSに従順である。細胞溶解物中のSTATのJAK依存性リン酸化を定量的にモニタリングするために使用できる5つの均質な細胞ベースの免疫アッセイプラットフォームが市販されている:SureFire、HTRF、LANCE、LanthaScreen、およびLumit。これらのプラットフォームにはそれぞれ長所と短所があります。
SureFireは発光酸素チャネリング技術に基づいており、ドナービーズとアクセプタービーズを使用して、一対の抗体を特異的に捕捉し、そのうちの1つはビオチン化されています。リン酸化タンパク質の存在下で、2つの抗体はドナービーズとアクセプタービーズを近接させ、化学発光シグナルの生成を可能にします6。汎用性と感度は高いものの、この技術は高価であり、培養液中のビオチンの影響を受け、周囲温度や光に非常に敏感であり、検出には特別なリーダーが必要です。HTRFとLANCEはどちらもTR-FRET技術に基づいており、ドナー分子として長寿命発光ランタノイドイオン錯体(ユウロピウムまたはテルビウムキレート、またはユウロピウムクリプテート)を使用し、アクセプター分子として遠赤色蛍光団7。ドナー分子またはアクセプター分子のいずれかで標識された2つのタンパク質特異的抗体が近接すると、FRETが発生し、アクセプター蛍光の増加およびドナー蛍光の減少を引き起こす。これらの長寿命蛍光シグナルは、時間分解およびレシオメトリック方式で測定できるため、アッセイ干渉を低減し、データ品質を向上させることができます。TR-FRETの他の利点は、光に敏感ではなく、繰り返し読み取りが可能で、長い信号安定性を示すことです。TR-FRETは、その汎用性、感度、および高い堅牢性のためにHTSに広く実装されていますが、すべての市販のTR-FRETベースのアッセイプラットフォームは高価であるため、学術的および小規模な産業研究所での幅広い採用を妨げています。LanthaScreenアッセイもTR-FRETベースの読み出しを使用しますが、緑色蛍光タンパク質(GFP)-STAT1融合タンパク質とテルビウム標識ホスホ特異的STAT1抗体を組み合わせた安定発現する操作されたU2OS細胞株に依存しています8。シグナル伝達タンパク質の選択が限られていることに加えて、この方法は高価なトランスフェクト細胞株を購入し、その適用性を低下させ、実験的アーチファクトの可能性を高める必要がある。Lumitは、NanoLuc Luciferase9の大小のNanoBitサブユニットで化学的に標識された二次抗体(抗マウスおよび抗ウサギ)を利用する一般的な生物発光免疫測定プラットフォームです。2つの一次抗体の標的タンパク質への結合は、二次抗体を近接させ、発光シグナルを生成する活性酵素を形成する。発光は一般に高感度で堅牢な読み出しですが、2つの異なる種で産生される一次抗体の要件により、アッセイ設計の選択肢が制限されます。さらに、複雑なサンプルマトリックスに二次抗体を使用すると、アッセイ干渉を受けやすくなる可能性があります。
したがって、HTSと互換性のある方法で個々のリン酸化タンパク質および総STATタンパク質を測定するための、信頼性が高く、迅速で、かつ手頃な価格の細胞ベースのアッセイプラットフォームの必要性が依然として存在する。このニーズに対応するために、強化されたTR-FRET技術(THUNDER)に基づいて新しいハイスループット細胞ベースのイムノアッセイプラットフォームが開発され、細胞ライセート中の内因的に発現された細胞内タンパク質(リン酸化または合計)のシンプルで高感度、堅牢で費用対効果の高い測定を可能にするように設計されています。この技術の利点は、優れたスペクトル適合性とTR-FRETシグナルを示すドナー/アクセプターFRETペア、厳密に検証された抗体、および最適化された溶解バッファーの組み合わせに由来します。これらのアッセイはサンドイッチイムノアッセイとしてフォーマットされ、簡単な3段階のワークフローを使用します(図1)。細胞は、まずタンパク質リン酸化を調節するように処理され、次いでキットに提供される特定の溶解緩衝液で溶解される。細胞溶解物中の標的リン酸化または総STATタンパク質は、標的タンパク質上の別個のエピトープを認識する一対のフルオロフォア標識抗体との単一の試薬添加およびインキュベーション工程で検出される(図2)。1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、2番目の抗体は遠赤色アクセプターフルオロフォア(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は溶液中のタンパク質に結合し、2つの標識を近接させる。ドナーのユウロピウムキレートを320または340nmで励起すると、アクセプターにFRETがトリガーされ、細胞溶解物中の標的タンパク質(リン酸化または合計)の濃度に比例した665nmで長寿命のTR-FRETシグナルを放出する。
図1:TR-FRETアッセイワークフロー ワークフローは、細胞処理、細胞溶解、TR-FRETを使用したタンパク質検出の3つのステップで構成されています。2プレートアッセイプロトコルでは、溶解液は白色384ウェル検出プレートに移されますが、1プレートプロトコルでは、すべてのステップが同じ白色384ウェル検出プレート(オールインワンウェルプロトコル)で行われます。使用されるアッセイプロトコルにかかわらず、タンパク質検出は同じ総容量(ウェルあたり20 μL)で行われます。略語: TR-FRET = 時間分解フェルスター共鳴エネルギー移動。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:TR-FRETサンドイッチ免疫測定法原理。 1つの抗体はユウロピウムキレートドナー(Eu-Ab1)で標識され、もう1つは遠赤色の小蛍光色素受容体(FR-Ab2)で標識されています。2つの標識抗体は、細胞ライセート中の標的タンパク質(リン酸化または全)上の異なるエピトープに特異的に結合し、2つの蛍光色素を近接させます。320または340nmでのドナーユーロピウムキレートの励起は、ドナーからアクセプター分子へのFRETを誘発し、次いで665nmでシグナルを放出する。このシグナルは、細胞溶解物中のタンパク質の濃度に比例する。特定の標的タンパク質がない場合、ドナーとアクセプターの蛍光色素は互いに離れすぎているため、FRETは発生しません。略語: FRET = フェルスター共鳴エネルギー移動;TR-FRET = 時間分解フレット;Ab = 抗体;FR = 極赤色。Eu – ユウロピウムキレート;P = リン酸化。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
ここでは、THUNDER TR-FRETプラットフォームを使用する付着細胞または浮遊細胞からの細胞溶解物中のリン酸化STAT1(Y701)、STAT3(Y705)、STAT4(Y693)、STAT5(Y694/Y699)、およびSTAT6(Y641)の細胞内レベルを、合計STAT1、STAT3、STAT5、およびSTAT6とともに測定するための詳細なプロトコルが、384ウェルフォーマットで提供されています。これらのプロトコルは、2 プレート転写プロトコルまたは 1 プレートオールインワンウェルプロトコルのいずれかを使用した細胞処理、溶解、および TR-FRET ベースの標的タンパク質検出の手順を定義します。これらの細胞ベースのアッセイは、JAK/STAT経路の既知の活性化剤および阻害剤の薬理学的プロファイルを決定するために適用される。HTSのための選択されたアッセイの堅牢性と適合性が実証されています。最後に、アッセイ最適化のための主要な実験と、アッセイのトラブルシューティングに関する推奨事項について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ウェスタンブロッティングやELISAベースの方法などの従来のリンタンパク質分析方法と比較して、THUNDER TR-FRET細胞アッセイのワークフローはシンプルで高速で、少量のサンプル(15 μL)を使用し、384ウェルフォーマットのHTS用に設計されており、自動化に非常に適しています。アッセイプロトコルは柔軟性があり、中スループットおよび高スループットの両方のアプリケーションに容易に適合さ…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
何一つ。
Materials
| 96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile | Corning | 3595 | This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used |
| 384-well microplate, white, low-volume | PerkinElmer | 6007290 | This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used |
| A431 cell line | ATCC | CRL-1555 | |
| Adhesive microplate seal | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| EnVision Xcite Multilabel plate reader | PerkinElmer | 2104-0020A | The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option |
| Erlotinib hydrochloride | Sigma | CDS022564 | |
| Falcon tissue culture treated flasks | Fisher | 13-680-65 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| HeLa cell line | ATCC | CCL-2 | |
| JAK Inhibitor 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| Orbital plate shaker | Many options available | Not applicable | |
| Recombinant human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant human IFNα2b | ProSpec | CYT-460 | |
| Recombinant human IL-4 | R&D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red |
| THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) + Total STAT4 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT4PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT5PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit | BioAuxilium Research | KIT-STAT6PT-500 | |
| Trypsin/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 cell line | ATCC | TIB-196 | |
| Ultrapure water | NA | NA | Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer |
Referências
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