Запись сетевой активности в спинальных ноцицептивных цепях с помощью микроэлектродных матриц
Summary
Описано совместное использование технологии микроэлектродных массивов и 4-аминопиридин-индуцированной химической стимуляции для исследования ноцицептивной активности на сетевом уровне в спинном роге спинного мозга.
Abstract
Роли и связность определенных типов нейронов в спинном роге спинного мозга (DH) очерчиваются с быстрой скоростью, чтобы обеспечить все более подробное представление о схемах, лежащих в основе обработки боли в позвоночнике. Тем не менее, влияние этих связей на более широкую сетевую активность в DH остается менее понятным, потому что большинство исследований сосредоточены на активности отдельных нейронов и небольших микросхем. В качестве альтернативы, использование микроэлектродных массивов (MEA), которые могут контролировать электрическую активность во многих клетках, обеспечивает высокое пространственное и временное разрешение нейронной активности. Здесь описано использование MEAs с срезами спинного мозга мыши для изучения активности DH, индуцированной химически стимулирующими схемами DH с 4-аминопиридином (4-AP). Результирующая ритмическая активность ограничена поверхностным DH, стабильна с течением времени, блокируется тетродотоксином и может быть исследована в различных ориентациях срезов. Вместе этот препарат обеспечивает платформу для исследования активности контура DH в тканях наивных животных, животных моделей хронической боли и мышей с генетически измененной ноцицептивной функцией. Кроме того, записи MEA в 4-AP-стимулированных срезах спинного мозга могут быть использованы в качестве инструмента быстрого скрининга для оценки способности новых антиноцицептивных соединений нарушать активность в спинном мозге DH.
Introduction
Роль специфических типов ингибирующих и возбуждающих интернейронов в ДГ спинного мозга раскрывается с быстрой скоростью 1,2,3,4. Вместе интернейроны составляют более 95% нейронов в DH и участвуют в сенсорной обработке, включая ноцицепцию. Кроме того, эти интернейронные цепи важны для определения того, поднимаются ли периферические сигналы по нейрооси, чтобы достичь мозга и способствовать восприятию боли 5,6,7. На сегодняшний день в большинстве исследований изучалась роль нейронов DH на уровне анализа одной клетки или всего организма с использованием комбинаций внутриклеточной электрофизиологии in vitro, нейроанатомической маркировки и поведенческого анализа in vivo 1,3,8,9,10,11,12,13,14 . Эти подходы значительно продвинули понимание роли конкретных популяций нейронов в обработке боли. Тем не менее, остается пробел в понимании того, как конкретные типы клеток и небольшие макроцепи влияют на большие популяции нейронов на уровне микросхем, чтобы впоследствии формировать выход DH, поведенческие реакции и болевой опыт.
Одной из технологий, которая может исследовать макросхему или функцию многоклеточного уровня, является микроэлектродная матрица (MEA)15,16. MEA использовались для исследования функции нервной системы в течение нескольких десятилетий17,18. В мозге они способствовали изучению развития нейронов, синаптической пластичности, фармакологического скрининга и тестирования токсичности17,18. Они могут использоваться как для приложений in vitro, так и in vivo, в зависимости от типа MEA. Кроме того, разработка МПС развивалась быстрыми темпами, и в настоящее время доступны различные номера и конфигурации электродов19. Ключевым преимуществом MEA является их способность одновременно оценивать электрическую активность во многих нейронах с высокой пространственной и временной точностью с помощью нескольких электродов15,16. Это обеспечивает более широкое считывание того, как нейроны взаимодействуют в цепях и сетях в условиях контроля и в присутствии локально применяемых соединений.
Одна из проблем препаратов DH in vitro заключается в том, что текущие уровни активности, как правило, низкие. Здесь эта проблема решается в цепях DH спинного мозга с использованием блокатора каналов K+ с напряжением, 4-аминопридина (4-AP), для химической стимуляции цепей DH. Этот препарат ранее применялся для установления ритмической синхронной электрической активности в ДГ острых срезов спинного мозга и при острых условиях in vivo 20,21,22,23,24. Эти эксперименты использовали одноклеточный пластырь и внеклеточную запись или кальциевую визуализацию для характеристики 4-AP-индуцированной активности 20,21,22,23,24,25. Вместе эта работа продемонстрировала потребность в возбуждающей и тормозной синаптической передаче и электрических синапсах для ритмической активности, индуцированной 4-AP. Таким образом, ответ 4-AP рассматривался как подход, который разоблачает нативные полисинаптические схемы DH с биологической значимостью, а не как эпифеномен, вызванный лекарственными средствами. Кроме того, активность, индуцированная 4-AP, демонстрирует аналогичный профиль реакции на анальгетические и противоэпилептические препараты, как невропатические болевые состояния, и была использована для предложения новых мишеней для анальгетических препаратов на основе позвоночника, таких как коннексины 20,21,22.
Здесь описан препарат, который сочетает в себе MEA и химическую активацию спинального DH с 4-AP для изучения этой ноцицептивной схемы на макроцептивном или сетевом уровне анализа. Этот подход обеспечивает стабильную и воспроизводимую платформу для исследования ноцицептивных цепей в наивных и невропатических «болевых» условиях. Этот препарат также легко применим для проверки действия известных анальгетиков на уровне схемы и для скрининга новых анальгетиков в гиперактивном спинном мозге.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несмотря на важность спинального DH в ноцицептивной передаче сигналов, обработке и результирующих поведенческих и эмоциональных реакциях, которые характеризуют боль, цепи в этой области остаются плохо изученными. Ключевой проблемой в исследовании этого вопроса было разнообразие попу…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансировалась Национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (гранты 631000, 1043933, 1144638 и 1184974 B.A.G. и R.J.C.) и Институтом медицинских исследований Хантера (грант B.A.G. и R.J.C.).
Materials
| 4-aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875-5G | |
| 100% ethanol | Thermo Fisher | AJA214-2.5LPL | |
| CaCl2 1M | Banksia Scientific | 0430/1L | |
| Carbonox (Carbogen – 95% O2, 5% CO2) | Coregas | 219122 | |
| Curved long handle spring scissors | Fine Science Tools | 15015-11 | |
| Custom made air interface incubation chamber | |||
| Foetal bovine serum | Thermo Fisher | 10091130 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Glucose | Thermo Fisher | AJA783-500G | |
| Horse serum | Thermo Fisher | 16050130 | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axiovert10 | |
| KCl | Thermo Fisher | AJA383-500G | |
| Ketamine | Ceva | KETALAB04 | |
| Large surgical scissors | Fine Science Tools | 14007-14 | |
| Loctite 454 Instant Adhesive | Bolts and Industrial Supplies | L4543G | |
| MATLAB | MathWorks | R2018b | |
| MEAs, 3-Dimensional | Multichannel Systems | 60-3DMEA100/12/40iR-Ti, 60-3DMEA200/12/50iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in an 8×8 square grid. Electrodes are 12 µm in diameter, 40 µm (100/12/40) or 50 µm (200/12/50) high and equidistantly spaced 100 µm (100/12/40) or 200 µm (200/12/50) apart. |
| MEA headstage | Multichannel Systems | MEA2100-HS60 | |
| MEA interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot | |
| MEA net | Multichannel Systems | ALA HSG-MEA-5BD | |
| MEA perfusion system | Multichannel Systems | PPS2 | |
| MEAs, Planar | Multichannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti, 60MEA500/30iR-Ti | 60 titanium nitride (TiN) electrodes with 1 internal reference electrode, organised in either a 8×8 square grid (200/30) or a 6×10 rectangular grid (500/30). Electrodes are 30 µm in diameter and equidistantly spaced 200 µm (200/30) or 500 µm (500/30) apart. |
| MgCl2 | Thermo Fisher | AJA296-500G | |
| Microscope camera | Motic | Moticam X Wi-Fi | |
| Multi Channel Analyser software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| Multi Channel Experimenter software | Multichannel Systems | V 2.17.4 | |
| NaCl | Thermo Fisher | AJA465-500G | |
| NaHCO3 | Thermo Fisher | AJA475-500G | |
| NaH2PO4 | Thermo Fisher | ACR207805000 | |
| Rongeurs | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Small spring scissors | Fine Science Tools | 91500-09 | |
| Small surgical scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| Sucrose | Thermo Fisher | AJA530-500G | |
| Superglue | cyanoacrylate adhesive | ||
| Tetrodotoxin | Abcam | AB120055 | |
| Vibration isolation table | Newport | VH3048W-OPT | |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 S |
Referências
- Smith, K. M., et al. Calretinin positive neurons form an excitatory amplifier network in the spinal cord dorsal horn. eLife. 8, 49190 (2019).
- Smith, K. M., et al. Functional heterogeneity of calretinin-expressing neurons in the mouse superficial dorsal horn: implications for spinal pain processing. The Journal of physiology. 593 (19), 4319-4339 (2015).
- Boyle, K. A., et al. Defining a spinal microcircuit that gates myelinated afferent input: Implications for tactile allodynia. Cell Reports. 28 (2), 526-540 (2019).
- Browne, T. J., et al. Transgenic cross-referencing of inhibitory and excitatory interneuron populations to dissect neuronal heterogeneity in the dorsal horn. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 32 (2020).
- Graham, B. A., Hughes, D. I. Rewards, perils and pitfalls of untangling spinal pain circuits. Current Opinion in Physiology. 11, 35-41 (2019).
- Todd, A. J. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nature Reviews Neuroscience. 11 (12), 823-836 (2010).
- Hughes, D. I., Todd, A. J. Central nervous system targets: inhibitory interneurons in the spinal cord. Neurotherapeutics. 17 (3), 874-885 (2020).
- Duan, B., et al. Identification of spinal circuits transmitting and gating mechanical pain. Cell. 159 (6), 1417-1432 (2014).
- Hachisuka, J., Chiang, M. C., Ross, S. E. Itch and neuropathis itch. Pain. 159 (3), 603 (2018).
- Foster, E., et al. Targeted ablation, silencing, and activation establish glycinergic dorsal horn neurons as key components of a spinal gate for pain and itch. Neuron. 85 (6), 1289-1304 (2015).
- Bourane, S., et al. Identification of a spinal circuit for light touch and fine motor control. Cell. 160 (3), 503-515 (2015).
- Cheng, L., et al. Identification of spinal circuits involved in touch-evoked dynamic mechanical pain. Nature neuroscience. 20 (6), 804-814 (2017).
- Peirs, C., et al. Mechanical allodynia circuitry in the dorsal horn is defined by the nature of the injury. Neuron. 109 (1), 73-90 (2021).
- Huang, J., et al. Circuit dissection of the role of somatostatin in itch and pain. Nature Neuroscience. 21 (5), 707-716 (2018).
- Obien, M. E. J., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2015).
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Johnstone, A. F., et al. Microelectrode arrays: a physiologically based neurotoxicity testing platform for the 21st century. Neurotoxicology. 31 (4), 331-350 (2010).
- Stett, A., et al. Biological application of microelectrode arrays in drug discovery and basic research. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 377 (3), 486-495 (2003).
- Xu, L., et al. Trends and recent development of the microelectrode arrays (MEAs). Biosensors and Bioelectronics. 175 (1), 112854 (2020).
- Chapman, R. J., Cilia La Corte, P. F., Asghar, A. U. R., King, A. E. Network-based activity induced by 4-aminopyridine in rat dorsal horn in vitro is mediated by both chemical and electrical synapses. The Journal of Physiology. 587, 2499-2510 (2009).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Epileptiform activity in rat spinal dorsal horn in vitro has common features with neuropathic pain. Pain. 105 (1-2), 327-338 (2003).
- Kay, C. W., Ursu, D., Sher, E., King, A. E. The role of Cx36 and Cx43 in 4-aminopyridine-induced rhythmic activity in the spinal nociceptive dorsal horn: an electrophysiological study in vitro. Physiological Reports. 4 (14), 12852 (2016).
- Jankowska, E., Lundberg, A., Rudomin, P., Sykova, E. Effects of 4-aminopyridine on synaptic transmission in the cat spinal cord. Brain Research. 240 (1), 117-129 (1982).
- Semba, K., Geller, H. M., Egger, M. D. 4-Aminopyridine induces expansion of cutaneous receptive fields of dorsal horn cells. Brain Research. 343 (2), 398-402 (1985).
- Ruscheweyh, R., Sandkühler, J. Long-range oscillatory Ca2+ waves in rat spinal dorsal horn. European Journal of Neuroscience. 22 (8), 1967-1976 (2005).
- Egert, U., et al. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Research Protocols. 2 (4), 229-242 (1998).
- Thiebaud, P., De Rooij, N., Koudelka-Hep, M., Stoppini, L. Microelectrode arrays for electrophysiological monitoring of hippocampal organotypic slice cultures. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 44 (11), 1159-1163 (1997).
- Rey, H. G., Pedreira, C., Quiroga, R. Q. Past, present and future of spike sorting techniques. Brain Research Bulletin. 119, 106-117 (2015).
- Satuvuori, E., et al. Measures of spike train synchrony for data with multiple time scales. Journal of Neuroscience Methods. 287, 25-38 (2017).
- Mendis, G. D. C., Morrisroe, E., Reid, C. A., Halgamuge, S. K., Petrou, S. Use of local field potentials of dissociated cultures grown on multi-electrode arrays for pharmacological assays. 38th Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. , 952-956 (2016).
- Hughes, D. I., et al. Morphological, neurochemical and electrophysiological features of parvalbumin-expressing cells: a likely source of axo-axonic inputs in the mouse spinal dorsal horn. The Journal of Physiology. 590 (16), 3927-3951 (2012).
- Peirs, C., Seal, R. P. Neural circuits for pain: recent advances and current views. Science. 354 (6312), 578-584 (2016).
- Li, J., Baccei, M. L. Developmental regulation of membrane excitability in rat spinal lamina I projection neurons. Journal of Neurophysiology. 107 (10), 2604-2614 (2012).
- Li, J., Baccei, M. L. Pacemaker neurons within newborn spinal pain circuits. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9010-9022 (2011).
- Sandkühler, J., Eblen-Zajjur, A. Identification and characterization of rhythmic nociceptive and non-nociceptive spinal dorsal horn neurons in the rat. Neurociência. 61 (4), 991-1006 (1994).
- Lucas-Romero, J., Rivera-Arconada, I., Roza, C., Lopez-Garcia, J. A. Origin and classification of spontaneous discharges in mouse superficial dorsal horn neurons. Scientific Reports. 8 (1), 9735-9735 (2018).
- Antonio, L., et al. L. al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. 260, 33-44 (2016).
- Avoli, M., Jefferys, J. G. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 260, 26-32 (2016).
- Taccola, G., Nistri, A. Low micromolar concentrations of 4-aminopyridine facilitate fictive locomotion expressed by the rat spinal cord in vitro. Neurociência. 126 (2), 511-520 (2004).
- Mitra, P., Brownstone, R. M. An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse. Journal of Neurophysiology. 107 (2), 728-741 (2012).
- Egert, U., Heck, D., Aertsen, A. Two-dimensional monitoring of spiking networks in acute brain slices. Experimental Brain Research. 142 (2), 268-274 (2002).
