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Bioquímica

Reconstituição da Atividade de Extração de Msp1 com Componentes Totalmente Purificados

Published: August 10, 2021
doi:
10.3791/62928
,
1Department of Chemistry & Biochemistry,University of Toledo

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para a reconstituição da atividade extração de Msp1 com componentes totalmente purificados em proteoliposomes definidos.

Abstract

Como centro de fosforilação oxidativa e regulação apoptótica, as mitocôndrias desempenham um papel vital na saúde humana. A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade para manter a homeostase proteica (proteostase). Declínios na proteostase mitocondrial têm sido ligados ao câncer, envelhecimento, neurodegeneração e muitas outras doenças. Msp1 é um AAA+ ATPase ancorado na membrana mitocondrial externa que mantém a proteostase removendo proteínas ancoradas na cauda deslocalizadas. Utilizando componentes purificados reconstituídos em proteoliposomes, mostramos que o Msp1 é necessário e suficiente para extrair um modelo de proteína ancorada na cauda de uma bicamada lipídica. Nosso sistema simplificado reconstituído supera várias das barreiras técnicas que têm dificultado o estudo detalhado da extração de proteínas de membrana. Aqui, fornecemos métodos detalhados para a geração de lipossomos, reconstituição de proteínas de membrana e o ensaio de extração de Msp1.

Introduction

A função celular adequada depende de um processo chamado proteostase, que garante que as proteínas funcionais estejam na concentração correta e localização celular1. Falhas na proteostase levam à função organela comprometida e estão associadas a muitas doenças neurodegenerativas2,3,4. As proteínas de membrana apresentam desafios únicos à rede de proteostase, pois devem ser direcionadas para a membrana correta, evitando a agregação dos domínios hidrofóbicos transmembrano (TMDs)5. Consequentemente, o maquinário especializado evoluiu para proteger o TMD hidrofóbico do citosol e facilitar a segmentação e inserção na membrana celular adequada6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

Mitocôndrias são o centro metabólico da célula e estão envolvidas em inúmeros processos celulares essenciais, tais como: fosforilação oxidativa, geração de aglomerados ferro-enxofre e regulação apoptótica16,17. Essas organelas endossímbiticas contêm duas membranas, conhecidas como a membrana mitocondrial interna (IMM) e a membrana mitocondrial externa (OMM). Mais de 99% das 1.500 proteínas mitocondriais humanas estão codificadas no genoma nuclear e precisam ser translocadas através de uma ou duas membranas diferentes18,19. A função mitocondrial adequada depende, portanto, de uma rede robusta de proteostase para corrigir quaisquer erros na segmentação ou translocação de proteínas.

Nosso laboratório se concentra em um subconjunto de proteínas de membrana mitocondrial chamadas proteínas ancoradas na cauda (TA), que têm um único domínio transmembrano no próprio C-terminus20,21,22,23,24. As proteínas TA estão envolvidas em uma série de processos essenciais, como apoptose, transporte de vesículas e translocação de proteínas25. A topologia única das proteínas TA requer a inserção pós-translacional, que ocorre no ânticulo endoplasmático (ER) pela Entrada Guiada de Extremidades Ancoradas (GET) ou Complexo de Proteína de Membrana Ticúrica Endoplasmática (EMC) ou no OMM por uma via mal caracterizada20,26,27,28. As propriedades biofísicas do TMD são necessárias e suficientes para guiar as proteínas TA para a membrana correta29. O reconhecimento de características biofísicas em vez de um motivo de sequência definida limita a fidelidade das vias de segmentação5. Assim, a málocalização das proteínas TA é um estresse comum para as redes de proteostase. O estresse celular, como a inibição da via GET, causa um aumento da mislocalização da proteína à OMM e disfunção mitocondrial, a menos que essas proteínas sejam prontamente removidas30,31.

Um tema comum na proteostase da membrana é o uso de proteínas AAA+ (ATPase Associated com ctivities celular A)proteínas para remover proteínas antigas, danificadas ou mislocalizadas da bicamada lipídica1,32,33,34,35,36,37,38 . As proteínas AAA+ são motores moleculares que formam anéis hexamericos e sofrem movimentos dependentes de ATP para remodelar um substrato, muitas vezes por translocação através de um poro axial estreito39,40. Embora grande esforço tenha sido dedicado ao estudo da extração de proteínas de membrana por ATPases AAA+, as reconstituições são complexas ou envolvem uma mistura de lipídios e detergente41,42, que limita o poder experimental de examinar o mecanismo de extração de substrato a partir da bicamada lipídica.

Msp1 é um ATPase AAA+ altamente conservado ancorado no OMM e peroxisoos que desempenha um papel crítico na proteostase da membrana, removendo proteínas TA mal localizadas43,44,45,46,47. O MSP1 também foi recentemente mostrado para aliviar o estresse de importação de proteínas mitocondriais, removendo proteínas de membrana que param durante a translocação através da OMM48. A perda de Msp1 ou o homólogo humano ATAD1 resulta em fragmentação mitocondrial, falhas na fosforilação oxidativa, convulsões, aumento da lesão após acidente vascular cerebral e morte precoce31,49,50,51,52,53,54,55,56.

Mostramos que é possível co-reconstituir proteínas TA com Msp1 e detectar a extração da bicamadas lipídica57. Este sistema simplificado utiliza proteínas totalmente purificadas reconstituídas em lipossomos definidos que imitam o OMM (Figura 1)58,59. Esse nível de controle experimental pode abordar questões mecanicistas detalhadas da extração de substratos que são experimentalmente intratáveis com reconstituições mais complexas envolvendo outras proteínas AAA+. Aqui, fornecemos protocolos experimentais detalhando nossos métodos de preparação de lipossomos, reconstituição de proteínas de membrana e o ensaio de extração. Esperamos que esses detalhes experimentais facilitem um estudo mais aprofundado do processo essencial, mas mal compreendido, da proteostase da membrana.

Protocol

1. Preparação liposomial Combine estoques de clorofórmio de lipídios em proporções apropriadas para imitar a membrana mitocondrial externa. Prepare 25 mg de mistura lipídica. Usamos uma mistura previamente estabelecida de lipídios que imitam membranas mitocondriais, constituído por uma razão molar de 48:28:10:10:4 de cerline de ovo de galinha fosfartidil (PC), ovo de frango fosfatidyl etanolamina (PE), inositol de fosfatidil hepático bovino (PI), sintético 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L…

Representative Results

Para interpretar corretamente os resultados, o gel livre de manchas e a mancha ocidental devem ser vistos juntos. O gel livre de manchas garante o carregamento igual em todas as amostras. Ao visualizar o gel livre de manchas, os acompanhantes (GST-calmodulin e GST-SGTA) serão visíveis nas pistas INPUT (I) e ELUTE (E). Verifique duas vezes se a intensidade dessas bandas é uniforme em todas as amostras de ENTRADA. Da mesma forma, certifique-se de que a intensidade é uniforme em todas as amostras de ELUTE. O ELUTE é 5x…

Discussion

A função mitocondrial adequada depende de um sistema robusto de controle de qualidade de proteína. Devido aos limites inerentes à fidelidade das vias de direcionamento da proteína TA, as proteínas T deslocalizadas são uma fonte constante de estresse para mitocôndrias. Um componente-chave da rede de proteostase mitocondrial é o Msp1, que é um ATPase AAA+ ancorado em membrana que remove proteínas TA mal localizadas do OMM. Aqui, descrevemos como preparar proteoliposomes, co-reconstituir Msp1 e uma proteína TA m…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

MLW desenvolveu parte deste protocolo durante seus estudos de pós-doutorado com o Dr. Robert Keenan na Universidade de Chicago.

Este trabalho é financiado pela concessão do NIH 1R35GM137904-01 à MLW.

Materials

Biobeads Bio-Rad 1523920
Bovine liver phosphatidyl inositol Avanti 840042C PI
Chicken egg phosphatidyl choline Avanti 840051C PC
Chicken egg phosphatidyl ethanolamine Avanti 840021C PE
ECL Select western blotting detection reagent GE RPN2235
Filter supports Avanti 610014
Glass vial VWR 60910L-1
Glutathione spin column Thermo Fisher PI16103
Goat anti-rabbit Thermo Fisher NC1050917
Mini-Extruder Avanti 610020
Polycarbonate membrane Avanti 610006 200 nM
PVDF membrane Thermo Fisher 88518 45 µM
Rabbit anti-FLAG Sigma-Aldrich F7245
Synthetic 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine Avanti 840035C DOPS
Synthetic 1',3'-bis[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho]-glycerol Avanti 710335C TOCL
Syringe, 1 mL Norm-Ject 53548-001
Syringe, 1 mL, gas-tight Avanti 610017
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Referências

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Keywords: Msp1AAA-ATPaseProtein Quality ControlReconstitutionLipid BilayerTA ProteinsLiposomesBioBeadsGlutathione Spin ColumnsExtraction AssaySDS-PAGE
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Citar este artigo
Fresenius, H. L., Wohlever, M. L. Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components. J. Vis. Exp. (174), e62928, doi:10.3791/62928 (2021).
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