Fabricación microfluídica de microcápsulas core-shell que transportan esferoides de células madre pluripotentes humanas
Summary
Este artículo describe la encapsulación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) utilizando un dispositivo de enfoque de flujo coaxial. Demostramos que esta tecnología de encapsulación microfluídica permite la formación eficiente de esferoides hPSC.
Abstract
Los cultivos tridimensionales (3D) o esferoides de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen los beneficios de mejorar los resultados de diferenciación y escalabilidad. En este artículo, describimos una estrategia para la formación robusta y reproducible de esferoides hPSC donde se utiliza un dispositivo de enfoque de flujo coaxial para atrapar hPSC dentro de microcápsulas de núcleo-caparazón. La solución central contenía suspensión unicelular de hPSCs y se hizo viscosa mediante la incorporación de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PEG) y medios de gradiente de densidad. La corriente de concha comprendía PEG-4 brazo-maleimida o PEG-4-Mal y fluía a lo largo de la corriente central hacia dos uniones de petróleo consecutivas. La formación de gotas ocurrió en la primera unión de aceite con una solución de cáscara que se envuelve alrededor del núcleo. La reticulación química de la cáscara se produjo en la segunda unión de aceite mediante la introducción de un reticulador de di-tiol (1,4-ditiotreitol o TDT) a estas gotas. El reticulante reacciona con los grupos funcionales maleimida a través de la química del clic, lo que resulta en la formación de una capa de hidrogel alrededor de las microcápsulas. Nuestra tecnología de encapsulación produjo cápsulas de 400 μm de diámetro a una velocidad de 10 cápsulas por segundo. Las cápsulas resultantes tenían una cubierta de hidrogel y un núcleo acuoso que permitía a las células individuales ensamblarse rápidamente en agregados y formar esferoides. El proceso de encapsulación no afectó negativamente la viabilidad de las hPSC, observándose una viabilidad del >95% 3 días después de la encapsulación. A modo de comparación, las hPSC encapsuladas en micropartículas de gel sólido (sin un núcleo acuoso) no formaron esferoides y tuvieron una viabilidad del <50% 3 días después de la encapsulación. La formación de esferoides de hPSC dentro de las microcápsulas de la cáscara del núcleo ocurrió dentro de las 48 h posteriores a la encapsulación, siendo el diámetro del esferoide una función de la densidad de inoculación celular. En general, la tecnología de encapsulación microfluídica descrita en este protocolo era adecuada para la encapsulación de hPSC y la formación de esferoides.
Introduction
Existe un interés considerable en los cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas (hPSC) debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que ofrece este formato de cultivo 1,2,3. Las hPSC se forman típicamente en esferoides u otros formatos de cultivo 3D por medio de biorreactores, micropocillos, hidrogeles y andamios poliméricos 4,5,6. La encapsulación ofrece otro medio para organizar hPSC individuales en esferoides. Una vez encapsulados, los esferoides hPSC se pueden manejar con facilidad y transferirse a placas de microtitulación para diferenciación, modelado de enfermedades o experimentos de prueba de drogas. El recubrimiento de hPSCs en una capa de hidrogel también protege las células contra el daño por cizallamiento y permite cultivar esferoides en un biorreactor a altas tasas de agitación7.
Nuestra metodología para la encapsulación de células madre evolucionó con el tiempo. En primer lugar, nos centramos en micropartículas sólidas de hidrogel y demostramos la encapsulación y el cultivo exitosos de células madre embrionarias de ratón (mESCs)8. Sin embargo, se observó que las células madre embrionarias humanas (hESC) tenían baja viabilidad cuando se encapsulaban en tales micropartículas de hidrogel, presumiblemente debido a la mayor necesidad de que estas células restablecieran los contactos célula-célula después de la encapsulación. Razonamos que la microcápsula heterogénea, que posee un núcleo acuoso, puede ser más adecuada para la encapsulación de células que dependen del rápido restablecimiento de los contactos célula-célula. El concepto de dispositivo microfluídico de enfoque de flujo coaxial para hacer microcápsulas de núcleo acuoso / cubierta de hidrogel se adaptó de He et al.9, pero en lugar de alginato empleado en el enfoque original, se incorporó un hidrogel basado en PEG en la cáscara. Primero demostramos la encapsulación exitosa y la formación de esferoides de hepatocitos primarios en microcápsulas núcleo-cáscara10 y, más recientemente, describimos la encapsulación de células hES e iPS7. Como se describe en la Figura 1A, las cápsulas se fabrican en un dispositivo de enfoque de flujo donde las corrientes de flujo de la cáscara y el núcleo pasan de lado a lado al flujo coaxial antes de la eyección a la fase de aceite. El flujo central contiene células y aditivos que aumentan la viscosidad de la solución (PEG MW 35kD no reactivo e iodixanol – nombre comercial OptiPrep) mientras que el flujo de la cáscara contiene moléculas reactivas (PEG-4-Mal). El flujo de flujo coaxial continuo se discretiza en gotas que conservan la arquitectura core-shell. La estructura núcleo-cáscara se hace permanente por la exposición al reticulador de di-tiol (TDT), que reacciona con PEG-4-Mal a través de la química del clic y da como resultado la formación de una piel o cáscara de hidrogel delgada (~ 10 μm). Después de que la emulsión se rompe y las cápsulas se transfieren a una fase acuosa, las moléculas de PEG se difunden desde el núcleo y son reemplazadas por moléculas de agua. Esto da como resultado microcápsulas de núcleo acuoso y cáscara de hidrogel.
A continuación se proporcionan instrucciones paso a paso sobre cómo hacer dispositivos microfluídicos, cómo preparar células y cómo llevar a cabo la encapsulación de hPSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
El proceso de encapsulación descrito aquí da como resultado la formación reproducible de esferoides hPSC. El formato de microcápsula facilita la dispensación de esferoides en pozos de una placa de microtitulación para experimentos destinados a mejorar / optimizar los protocolos de diferenciación o probar terapias. Los esferoides de células madre encapsuladas también se pueden usar en cultivos en suspensiones donde la cubierta de hidrogel protege las células contra el daño inducido por el cizallamiento<sup clas…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado en parte por las subvenciones del Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic, la Fundación J. W. Kieckhefer, la Fundación Al Nahyan, Medicina Regenerativa de Minnesota (RMM 101617 TR 004) y los NIH (DK107255).
Materials
| 0.22 µm Syringe Filters | Genesee Scientific | 25-244 | |
| 1 ml syringe luer-lock tip | BD | 309628 | |
| 1x DPBS | Corning | 23220003 | |
| 4-arm PEG maleimide, 10kDa | Laysan Inc. | 164-68 | |
| 5 ml syringe luer-lock tip | BD | 309646 | |
| 6-WELL NON-TREATED PLATE | USA Scientific | CC7672-7506 | |
| Aquapel Applicator Pack | Aquapel Glass Treatment | 47100 | |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD v2020 | |
| CELL STRAINER 100 µm pore size | cardinal | 335583 | |
| Chlorotrimethylsilane | Aldrich | 386529-100mL | |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Life technology | A27974 | |
| Digital hot plate | Dataplate | ||
| Digital vortex mixer | Fisher Scientific | 215370 | |
| Distilled water | Gibco | 15230-162 | |
| Dithiotheritol (DTT) | Sigma | D0632-10G | |
| DMEM/F12 media | gibco | 11320-033 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 14-959-53A | |
| Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge | live | 13-100-675 | |
| HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Inverted Fluorescence Motorized Microscope | Olympus | Olympus IX83 | |
| Laurell Spin Coaters | Laurell Technologies | WS-650MZ-23NPPB | |
| Live/Dead mammalian staining kit | Fisher | L3224 | |
| Magic tape | Staples | 483535 | |
| Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.) | Scientific Commodities, Inc | BB31695-PE/2 | |
| Micro stir bar | Daigger Scientific | EF3288E | |
| MilliporeSigma Filter Forceps | Fisher scientific | XX6200006P | |
| Mineral oil | Sigma | M8410-1L | |
| mTeSR 1 Basal Medium | STEMCELL TECHNOLOGY | 85850 | |
| Needles-Stainless Steel 14 Gauge | CML supply | 901-14-025 | |
| Needles-Stainless Steel 15 Gauge | CML supply | 901-15-050 | |
| OptiPrep | STEMCELL TECHNOLOGY | 7820 | |
| Oven | Thermo Scientific | HERA THERM Oven | |
| Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin) | Gemini | 400-109 | |
| Petri Dish 150X20 Sterile Vent | Sarstedt, Inc. | 82.1184.500 | |
| Plasma Cleaning System | Yield Engineering System, Inc. | YES-G500 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| Poly(ethylene glycol) 35kDa | Sigma | 94646-250G-F | |
| PrecisionGlide Needle 27G | BD | 305109 | |
| Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride | SELLECK CHEM | S1049-10mg | |
| Silicon wafer 100mm | University Wafer | 452 | |
| Slide glass (75mm ´ 25mm) | CardinalHealth | M6146 | |
| Span 80 | Sigma | S6760-250ML | |
| SpeedMixer | Thinky | ARE-310 | |
| Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm) | Costar | 8160 | |
| SU-8 2025 | Kayaku Advanced Materials | Y111069 0500L1GL | |
| SU-8 developer | Kayaku Advanced Materials | Y020100 4000L1PE | |
| Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades | fisher scientific | 22-079-684 | |
| SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow Corning | 2065622 | |
| Syringe pump | New Era Pump System, Inc | NE-4000 | |
| Triethanolamine | Sigma-aldrich | T58300-25G | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-013 | |
| Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-01 | |
| Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.) | Cole-Parmer | 06419-04 | |
| Ultrasonic cleaner FS20D | Fisher Scientific | CPN-962-152R | |
| Vacuum desiccator | Bel-Art | F42025-0000 | |
| Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x | ZEISS | 435421-0000-000 | |
| μPG 101 laser writer | Heidelberg Instruments | HI 1128 |
Referências
- Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
- Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
- Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
- Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
- Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
- Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
- Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
- Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
- Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
- Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
- Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
- Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
- Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
- You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).
