استخدام شاشة Phage لتطوير المغيرات المتغيرة في كل مكان ل E3 Ligases
Summary
إن التكوير في كل مكان هو تعديل حاسم للبروتين بعد الترجمه ، وقد تورط خلل التنظيم في العديد من الأمراض البشرية. هذا البروتوكول تفاصيل كيف يمكن استخدام عرض phage لعزل المتغيرات في كل مكان الرواية التي يمكن ربط وتعديل نشاط ليجار E3 التي تتحكم في خصوصية وكفاءة وأنماط في كل مكان.
Abstract
يوبيكيتين هو بروتين صغير 8.6 كدا الذي هو عنصر أساسي في نظام ubiquitin-proteasome. وبالتالي، فإنه يمكن ربط لمجموعة متنوعة من البروتينات مع خصوصية عالية ولكن تقارب منخفض. من خلال عرض phage ، يمكن هندسة متغيرات Ubiquitin (UbVs) بحيث تظهر تقاربا محسنا على النمط البري في كل مكان وتحافظ على خصوصية ملزمة لاستهداف البروتينات. تستخدم شاشة Phage مكتبة phagemid ، حيث يتم دمج بروتين معطف pIII من البكتيريا M13 الخيطية (التي تم اختيارها لأنه يتم عرضها خارجيا على سطح phage) مع UbVs. المخلفات المحددة من النمط البري البشري في كل مكان لينة وعشوائية (أي، هناك تحيز نحو تسلسل النمط البري الأصلي) لتوليد UbVs بحيث يتم تجنب التغييرات الضارة في تشكيل البروتين مع إدخال التنوع اللازم لتعزيز التفاعلات الجديدة مع البروتين المستهدف. خلال عملية عرض phage ، يتم التعبير عن هذه UbVs وعرضها على بروتينات معطف phage ويتم تحريكها مقابل بروتين مهم. يتم الاحتفاظ UbVs التي تظهر التفاعلات ملزمة مواتية مع البروتين المستهدف، في حين يتم غسلها المجلدات الفقراء بعيدا وإزالتها من بركة المكتبة. يتم إعادة تركيب المركبات المحتفظ بها ، والتي ترتبط بجسيمات الفياج التي تحتوي على الفاجم المقابل ل UbV ، وتضخيمها وتركيزها بحيث يمكن تحريكها ضد نفس البروتين المستهدف في جولة أخرى من عرض phage. عادة، يتم تنفيذ ما يصل إلى خمس جولات من عرض phage، خلالها يتم فرض ضغط اختيار قوي ضد UbVs التي تربط ضعيفة و / أو مشوش بحيث يتم تركيز أولئك الذين لديهم تقارب أعلى وإثراء. في نهاية المطاف، يتم عزل UbVs التي تثبت خصوصية أعلى و / أو تقارب للبروتين المستهدف من نظرائهم من النوع البري ويمكن وصفها من خلال مزيد من التجارب.
Introduction
إن فهم التفاصيل الجزيئية للتفاعلات بين البروتين والبروتين أمر بالغ الأهمية لتحديد آليات نقل الإشارات للعمليات البيولوجية، وخاصة تلك التي تساهم في الأمراض المهمة سريريا. في السنوات الأخيرة، تم استخدام عرض phage كطريقة عملية ويمكن الوصول إليها لعزل البروتينات / الببتيدات مع ربط محسنة كثيرا إلى البروتين المستهدف المطلوب1،2،3،4، والتي بدورها يمكن استخدامها كمسبارات داخل الخلايا من التفاعلات البروتين البروتين.
في كل مكان هو سلسلة من الأنشطة الأنزيمية (E1 تنشيط إنزيم → E2 اقتران انزيم → ليغاز E3) التي تترافق بشكل متناقض في كل مكان (Ub) إلى ركائز البروتين لاستهدافهم للتدهور أو للتوسط في التغيرات إشارات الخلية. وبالإضافة إلى ذلك، deubiquitinases تحفيز إزالة كل مكان من البروتينات. لذلك ، في الخلايا ، هناك الآلاف من التفاعلات البروتينية البروتينية المعتمدة على Ub ، والغالبية العظمى منها تعترف بسطح مشترك مع تقارب منخفض ولكن خصوصية عالية للسماح بالتفاعلات الضعيفة من خلال الأسطح الكبيرة والمتنوعة.
أدخل إرنست وآخرون طفرات في المناطق الملزمة المعروفة في Ub من أجل معرفة ما إذا كان بإمكانهم تعزيز التقارب الملزم لبروتين ذي أهمية مع الحفاظ على الانتقائية العالية5. تم تطوير مكتبة مشتركة تضم أكثر من 10 مليارات (7.5 × 1010) من متغيرات Ub (UbVs) مع طفرات في مواقع عبر سطح Ub تتوسط في التفاعلات المعروفة بين البروتينUb. تألفت هذه المكتبة من phagemids التي تعبر عن بروتين معطف M13 bacteriophage pIII المنصهر في UbVs المتنوعة. لذلك ، يمكن عرض UbVs الفردية على سطح phage عبر بروتين المعطف عند التعبير. خلال عملية الاختيار ، سيتم الاحتفاظ بالphage التي تعرض UbVs مع تفاعلات ملزمة كبيرة مع البروتين المستهدف وإثراؤها في الجولات اللاحقة من عرض phage ، في حين يتم غسل phage عرض UbVs التي ترتبط بشكل سيئ بالبروتين المستهدف وإزالتها من بركة phage. تحتوي جزيئات ال phage المحتفظ بها على الفاغميد المقابل ل UbV المعروض ، مما يسمح بتسلسلها وتميزها مرة أخرى بمجرد عزلها.
باستخدام هذه الاستراتيجية الهندسية البروتين، تم تطوير مثبطات UbV ل deubiquitinases5 الإنسان وبروتيازيس6 الفيروسية. الأهم من ذلك ، لقد قمنا بتوليد UbVs المثبطة لE3 ligases HECT الأسرة البشرية من خلال اختطاف موقع E2 ملزمة وتفعيل UbVs التي تحتل exosite Ub ملزمة على domain7 HECT. يمكننا أيضا أن تمنع monomeric RING-الأسرة E3s من خلال استهداف موقع الربط E2 وحمل UbV dimerization لتنشيط هوموديمريك RING E3s8. بالنسبة إلى وحدات RING E3 متعددة الوحدات، يمكن أن تحقق UbVs تثبيطا من خلال استهداف الوحدة الفرعية RING (على سبيل المثال، بالنسبة إلى APC/C complex9) أو تعطيل التكوين المعقد (على سبيل المثال، ل SCF E3s10). بشكل جماعي ، يمكن الاستفادة من UbVs لاستجواب التفاعلات بين البروتين والبروتين بشكل منهجي في نظام Ub-proteasome (UPS) حتى نتمكن من فك الآليات الكيميائية الحيوية لإنزيمات UPS بشكل أفضل وتحديد المواقع الوظيفية للتدخل العلاجي والتحقق من صحتها.
يصف البروتوكول التالي كيفية استخدام مكتبة UbV المعروضة التي تم إنشاؤها مسبقا لاستهداف بروتين ذي أهمية وكيفية إثراء ملفات UbV التي تتفاعل مع البروتين المستهدف من خلال جولات متتالية من عرض phage.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر في الخطوة 2.1 (إعداد البروتين)، يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الطرق لتقييم تركيز البروتين، وسيكون لكل منها فوائد وعيوب فريدة من نوعها على أساس البروتين المستهدف المحدد المستخدم لعرض الفواج. وقد تم توفير مصدر للأوصاف التفصيلية والبروتوكولات للطرق الشعبية سابقا11.
<p clas…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم ابتكار تقنية متغير ubiquitin في مختبر الدكتور ساشديف سيدهو (جامعة تورنتو). WZ حاليا باحث CIFAR Azrieli العالمية في البشر وبرنامج الميكروبيوم. تم تمويل هذا البحث من قبل NSERC ديسكفري المنح الممنوحة لWZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
Referências
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. Bioquímica. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
