फेज प्रदर्शन का उपयोग करने के लिए E3 Ligases के लिए Ubiquitin संस्करण Modulators विकसित करने के लिए
Summary
एक महत्वपूर्ण प्रोटीन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन है, जिसमें से कई मानव रोगों में फंस गया है। यह प्रोटोकॉल विवरण देता है कि कैसे फेज डिस्प्ले का उपयोग उपन्यास यूबिकिटिन वेरिएंट को अलग करने के लिए किया जा सकता है जो ई 3 लिगेस की गतिविधि को बांध और संशोधित कर सकता है जो विशिष्टता, दक्षता और पैटर्न को नियंत्रित करता है।
Abstract
Ubiquitin एक छोटा सा 8.6 kDa प्रोटीन है जो ubiquitin-antision system का एक मुख्य घटक है। नतीजतन, यह उच्च विशिष्टता लेकिन कम आत्मीयता के साथ प्रोटीन की एक विविध सरणी से बंध सकता है। फेज डिस्प्ले के माध्यम से, यूबिकिटिन वेरिएंट (यूबीवी) को इस तरह से इंजीनियर किया जा सकता है कि वे वाइल्डटाइप यूबिकिटिन पर बेहतर आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं और प्रोटीन को लक्षित करने के लिए बाध्यकारी विशिष्टता बनाए रखते हैं। फेज डिस्प्ले एक फेजमिड लाइब्रेरी का उपयोग करता है, जिससे एक फिलामेंटस एम 13 बैक्टीरियोफेज के पीआईआईआई कोट प्रोटीन (चुना जाता है क्योंकि यह फेज सतह पर बाहरी रूप से प्रदर्शित होता है) यूबीवी के साथ जुड़ा हुआ है। मानव wildtype ubiquitin के विशिष्ट अवशेष नरम और यादृच्छिक हैं (यानी, देशी wildtype अनुक्रम के लिए एक पूर्वाग्रह है) UbVs उत्पन्न करने के लिए ताकि प्रोटीन संरचना में हानिकारक परिवर्तन से बचा जा सके, जबकि लक्ष्य प्रोटीन के साथ उपन्यास बातचीत को बढ़ावा देने के लिए आवश्यक विविधता को पेश करते समय। फेज डिस्प्ले प्रक्रिया के दौरान, इन यूबीवी को व्यक्त किया जाता है और फेज कोट प्रोटीन पर प्रदर्शित किया जाता है और ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ पैन किया जाता है। लक्ष्य प्रोटीन के साथ अनुकूल बाध्यकारी इंटरैक्शन प्रदर्शित करने वाले यूबीवी को बनाए रखा जाता है, जबकि खराब बाइंडर्स को धोया जाता है और लाइब्रेरी पूल से हटा दिया जाता है। बनाए रखा UbVs, जो UbV के इसी फेजमिड युक्त फेज कण से जुड़े होते हैं, को eluted, प्रवर्धित और केंद्रित किया जाता है ताकि उन्हें फेज डिस्प्ले के एक और दौर में एक ही लक्ष्य प्रोटीन के खिलाफ पैन किया जा सके। आमतौर पर, फेज डिस्प्ले के पांच राउंड तक किए जाते हैं, जिसके दौरान यूबीवी के खिलाफ एक मजबूत चयन दबाव लगाया जाता है जो कमजोर रूप से और / या अस्पष्ट रूप से बांधते हैं ताकि उच्च आत्मीयता वाले लोग केंद्रित और समृद्ध हों। आखिरकार, यूबीवी जो अपने वाइल्डटाइप समकक्षों की तुलना में लक्ष्य प्रोटीन के लिए उच्च विशिष्टता और / या आत्मीयता प्रदर्शित करते हैं, उन्हें अलग-थलग कर दिया जाता है और आगे के प्रयोगों के माध्यम से इसकी विशेषता हो सकती है।
Introduction
प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के आणविक विवरणों को समझना जैविक प्रक्रियाओं के सिग्नल ट्रांसडक्शन तंत्र को चित्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से वे जो नैदानिक रूप से महत्वपूर्ण बीमारियों में योगदान करते हैं। हाल के वर्षों में, फेज डिस्प्ले का उपयोग प्रोटीन / पेप्टाइड्स को अलग करने के लिए एक व्यावहारिक और सुलभ विधि के रूप में किया गया है, जिसमें वांछित लक्ष्य प्रोटीन 1,2,3,4 के लिए बहुत बेहतर बंधन है, जिसे बदले में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन की इंट्रासेल्युलर जांच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
एंजाइमेटिक गतिविधियों का एक झरना है (E1 सक्रिय एंजाइम → E2 संयुग्मन एंजाइम → E3 ligases) है कि covalently संयुग्मित ubiquitin (यूबी) प्रोटीन substrates के लिए उन्हें गिरावट के लिए लक्षित करने के लिए या सेल सिग्नलिंग परिवर्तन मध्यस्थता करने के लिए। इसके अलावा, deubiquitinases प्रोटीन से ubiquitin को हटाने के लिए उत्प्रेरित. इसलिए, कोशिकाओं में, हजारों यूबी-निर्भर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन होते हैं, जिनमें से अधिकांश बड़े और विविध सतहों के माध्यम से कमजोर इंटरैक्शन की अनुमति देने के लिए कम आत्मीयता लेकिन उच्च विशिष्टता के साथ एक आम सतह को पहचानते हैं।
अर्न्स्ट एट अल ने यूबी के ज्ञात बाध्यकारी क्षेत्रों में उत्परिवर्तन पेश किया ताकि यह देखा जा सके कि क्या वे ब्याज के प्रोटीन के लिए बाध्यकारी आत्मीयता को बढ़ा सकते हैं, जबकि अभी भी उच्च चयनात्मकता को बनाए रख सकते हैं5। यूबी सतह पर पदों पर उत्परिवर्तन के साथ 10 बिलियन (7.5 x 1010) यूबी वेरिएंट (यूबीवी) की एक संयुक्त पुस्तकालय विकसित की गई थी जो ज्ञात यूबी-प्रोटीन इंटरैक्शन की मध्यस्थता करती है। इस पुस्तकालय में फेजमिड्स शामिल थे जो M13 बैक्टीरियोफेज pIII कोट प्रोटीन को विविध यूबीवी से जोड़ते हैं। इसलिए, अभिव्यक्ति पर कोट प्रोटीन के माध्यम से फेज सतह पर व्यक्तिगत यूबीवी प्रदर्शित किए जा सकते हैं। चयन प्रक्रिया के दौरान, फेज जो लक्ष्य प्रोटीन के साथ काफी बाध्यकारी इंटरैक्शन के साथ यूबीवी प्रदर्शित करता है, उसे फेज डिस्प्ले के बाद के दौर में बनाए रखा जाएगा और समृद्ध किया जाएगा, जबकि फेज प्रदर्शित करने वाले यूबीवी जो लक्ष्य प्रोटीन को खराब रूप से बांधते हैं, उन्हें धोया जाता है और फेज पूल से हटा दिया जाता है। बनाए रखा फेज कणों में उनके प्रदर्शित यूबीवी के अनुरूप फेजमिड होता है, जिससे उन्हें अनुक्रमित किया जा सकता है और एक बार अलग होने के बाद आगे की विशेषता होती है।
इस प्रोटीन इंजीनियरिंग रणनीति का उपयोग करते हुए, UbV अवरोधकों को मानव deubiquitinases5 और वायरल proteases6 के लिए विकसित किया गया था। महत्वपूर्ण रूप से, हमने मानव HECT-परिवार E3 लिगेस के लिए निरोधात्मक UBVs उत्पन्न किए हैं, जो E2-बाइंडिंग साइट को हाइजैक करने और UBVs को सक्रिय करने के माध्यम से है जो HECT डोमेन 7 पर यूबी-बाइंडिंग एक्सोसाइट पर कब्जा कर लेते हैं। हम E2 बाध्यकारी साइट को लक्षित करके मोनोमेरिक रिंग-परिवार E3s को भी रोक सकते हैं और होमोडिमेरिक रिंग E3s8 को सक्रिय करने के लिए UbV dimerization को प्रेरित कर सकते हैं। मल्टी-सबयूनिट रिंग E3s के लिए, UbVs रिंग सबयूनिट को लक्षित करके निषेध प्राप्त कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, APC / C complex9 के लिए) या जटिल गठन को बाधित कर सकते हैं (उदाहरण के लिए, SCF E3s10 के लिए)। सामूहिक रूप से, यूबीवी को व्यवस्थित रूप से प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन से पूछताछ करने के लिए लाभ उठाया जा सकता है यूबी-एंटीऑक्सम सिस्टम (यूपीएस) ताकि हम यूपीएस एंजाइमों के जैव रासायनिक तंत्र को बेहतर ढंग से समझ सकें और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए कार्यात्मक साइटों की पहचान और सत्यापन कर सकें।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है कि ब्याज के प्रोटीन को लक्षित करने के लिए पहले से उत्पन्न फेज प्रदर्शित यूबीवी लाइब्रेरी को कैसे नियोजित किया जाए और फेज डिस्प्ले के क्रमिक दौर के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन के साथ बातचीत करने वाले यूबीवी बाइंडर्स को कैसे समृद्ध किया जाए।
Protocol
Representative Results
Discussion
जैसा कि चरण 2.1 (प्रोटीन तैयारी) में उल्लेख किया गया है, प्रोटीन एकाग्रता का आकलन करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है, और प्रत्येक में फेज डिस्प्ले के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट लक्ष्य …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यूबिकिटिन वेरिएंट तकनीक को डॉ सचदेव सिद्धू (टोरंटो विश्वविद्यालय) की प्रयोगशाला में तैयार किया गया था। WZ वर्तमान में मनुष्यों और माइक्रोबायोम कार्यक्रम में एक CIFAR Azrieli ग्लोबल स्कॉलर है। इस शोध को NSERC डिस्कवरी ग्रांट्स द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जो WZ (RGPIN-2019-05721) को दिया गया था।
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
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