Allestedsnærværende er et kritisk protein post-translasjonell modifikasjon, hvorav dysregulering har vært involvert i mange menneskelige sykdommer. Denne protokollen beskriver hvordan phage display kan brukes til å isolere nye allestedsnærværende varianter som kan binde og modulere aktiviteten til E3 ligaer som styrer spesifisiteten, effektiviteten og mønstrene for allestedsnærværende.
Ubiquitin er et lite 8,6 kDa protein som er en kjernekomponent i allestedsnærværende proteasomsystemet. Følgelig kan det binde seg til et mangfoldig utvalg av proteiner med høy spesifisitet, men lav affinitet. Gjennom phage display, allestedsnærværende varianter (UbVs) kan konstrueres slik at de viser forbedret affinitet over wildtype ubiquitin og opprettholde bindende spesifisitet til mål proteiner. Phage display benytter et phagemid bibliotek, hvorved pIII-frakkproteinet til en filamentøs M13 bakteriofage (valgt fordi den vises eksternt på phageoverflaten) er smeltet sammen med UbVs. Spesifikke rester av menneskelig wildtype ubiquitin er myke og randomiserte (dvs. det vil si at det er en skjevhet mot innfødt wildtype-sekvens) for å generere UbVs slik at skadelige endringer i proteinkonformasjon unngås mens du introduserer mangfoldet som er nødvendig for å fremme nye interaksjoner med målproteinet. Under phage display prosessen, disse UbVs uttrykkes og vises på phage frakk proteiner og panorert mot et protein av interesse. UbVs som viser gunstige bindende interaksjoner med målproteinet beholdes, mens dårlige bindemidler vaskes bort og fjernes fra biblioteksbassenget. De beholdte ubvene, som er festet til phage-partikkelen som inneholder UbVs tilsvarende phagemid, blir elutert, forsterket og konsentrert slik at de kan panoreres mot det samme målproteinet i en annen runde med phage-skjerm. Vanligvis utføres opptil fem runder med phage-skjerm, hvor et sterkt utvalgstrykk pålegges ubvs som binder seg svakt og / eller promiskuøst slik at de med høyere affiniteter konsentreres og berikes. Til syvende og sist er UbVs som demonstrerer høyere spesifisitet og / eller affinitet for målproteinet enn deres wildtype-kolleger isolert og kan karakteriseres gjennom ytterligere eksperimenter.
Forståelse av molekylære detaljer om proteinproteininteraksjoner er avgjørende for å avgrense signaltransduksjonsmekanismene til biologiske prosesser, spesielt de som bidrar til klinisk viktige sykdommer. De siste årene har phage display blitt brukt som en praktisk og tilgjengelig metode for å isolere proteiner / peptider med mye forbedret binding til et ønsket målprotein1,2,3,4, som igjen kan brukes som intracellulære sonder av proteinproteininteraksjoner.
Allestedsnærværende er en kaskade av enzymatiske aktiviteter (E1 aktiverende enzym → E2 konjugaterende enzym → E3 ligaer) som kovalent konjugerer allestedsnærværende (Ub) til protein substrater for å målrette dem for nedbrytning eller for å megle cellesignalering endringer. I tillegg katalyserer deubiquitinases fjerning av ubiquitin fra proteiner. Derfor, i celler, er det tusenvis av Ub-avhengige proteinproteininteraksjoner, hvorav de aller fleste gjenkjenner en felles overflate med lav affinitet, men høy spesifisitet for å tillate svake interaksjoner gjennom store og forskjellige overflater.
Ernst et al. introduserte mutasjoner i kjente bindende regioner i Ub for å se om de kunne forbedre bindende affinitet for et protein av interesse samtidig som de opprettholder høy selektivitet5. Et kombinatorisk bibliotek med over 10 milliarder (7,5 x 1010) Ub-varianter (UbVs) med mutasjoner i posisjoner over hele Ub-overflaten som formidler de kjente Ub-proteininteraksjonene ble utviklet. Dette biblioteket besto av phagemids som uttrykker M13 bakteriofage pIII frakkprotein smeltet til diversifiserte ubVs. Derfor kan individuelle UbVs vises på phage overflaten via frakkproteinet ved uttrykk. Under utvelgelsesprosessen vil phage som viser UbVs med betydelige bindende interaksjoner med målproteinet bli beholdt og beriket i påfølgende runder med phage display, mens phage viser UbVs som binder dårlig til målproteinet vaskes bort og fjernes fra phage bassenget. De beholdte phagepartiklene inneholder phagemid som tilsvarer deres viste UbV, slik at de kan sekvenseres og ytterligere karakteriseres når de er isolert.
Ved hjelp av denne proteinteknologistrategien ble UbV-hemmere utviklet for humane deubiquitinases5 og virale proteaser6. Viktigst av alt, vi har generert hemmende ubVs for humane HECT-familie E3 ligaer gjennom kapring av E2-bindende nettstedet og aktivere UbVs som opptar en Ub-bindende exosite på HECT-domenet7. Vi kan også hemme monomeriske RING-familie E3-er ved å målrette E2-bindingsstedet og indusere UbV-dimmerisering for å aktivere homodimerisk RING E3s8. For ring E3-er med flere underenheter kan ubVer oppnå hemming ved å målrette mot RING-underenheten (f.eks. for APC/C-kompleks9) eller forstyrre kompleks formasjon (f.eks. for SCF E3s10). Samlet kan ubvs utnyttes til systematisk å forhøre proteinproteininteraksjoner i Ub-proteasome-systemet (UPS) slik at vi bedre kan dechiffrere biokjemiske mekanismer for UPS-enzymer og for å identifisere og validere funksjonelle steder for terapeutisk inngrep.
Følgende protokoll beskriver hvordan du bruker et tidligere generert phage som vises UbV-biblioteket for å målrette mot et protein av interesse og hvordan du beriker UbV-bindemidlene som samhandler med målproteinet gjennom påfølgende runder med phage-visning.
Som nevnt i trinn 2.1 (proteinpreparat), kan en rekke metoder brukes til å vurdere proteinkonsentrasjonen, og hver vil ha unike fordeler og ulemper basert på det spesifikke målproteinet som brukes til phage display. En kilde til detaljerte beskrivelser og protokoller for populære metoder har blitt gitt tidligere11.
Ved å bruke phage beholdt av en tidligere runde av phage display som inngang for en etterfølgende runde beriker de gode bindemidler ved gradvis å fjer…
The authors have nothing to disclose.
Ubiquitin-variantteknologien ble utviklet i laboratoriet til Dr. Sachdev Sidhu (University of Toronto). WZ er for tiden CIFAR Azrieli Global Scholar in the Humans &The Microbiome Program. Denne forskningen ble finansiert av NSERC Discovery Grants tildelt WZ (RGPIN-2019-05721).
Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |