מודל דימום טרנסקציה של וריד זנב בהמופיליה מורדמת לחלוטין עכברים

Summary

מודל הדימום של זנב זנב מעודן (TVT) בעכברים מורדמים הוא שיטת in vivo רגישה להערכת דימום המופילי. מודל דימום TVT ממוטב זה משתמש באובדן דם ובזמן דימום כנקודות קצה, תוך זיקוק מודלים אחרים והימנעות ממוות כנקודת קצה.

Abstract

מודלים של דימום זנב הם כלים חשובים בחקר המופיליה, במיוחד להערכת השפעות פרו-קרישיות. מודל ההישרדות של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) הועדף במסגרות רבות בשל רגישות למינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של FVIII, בעוד שמודלים מבוססים אחרים, כגון מודל קליפ הזנב, דורשים רמות גבוהות יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות. כדי להימנע משימוש בהישרדות כנקודת קצה, פיתחנו מודל TVT המבסס איבוד דם וזמן דימום כנקודות קצה והרדמה מלאה במהלך הניסוי כולו. בקצרה, עכברים מורדמים ממוקמים כאשר הזנב שקוע במי מלח ממוזגים (37 מעלות צלזיוס) ומנונים עם תרכובת הבדיקה בווריד הזנב הצדדי הימני. לאחר 5 דקות, וריד הזנב הצדדי השמאלי עובר טרנסקט באמצעות מדריך תבנית, הזנב מוחזר למלח, וכל פרקי הדימום מנוטרים ומתועדים במשך 40 דקות תוך כדי איסוף הדם. אם לא מתרחש דימום במשך 10 דקות, 20 דקות או 30 דקות לאחר הפציעה, הקריש מאותגר בעדינות על ידי ניגוב החתך פעמיים עם ספוגית גזה רטובה. לאחר 40 דקות, איבוד הדם מכמת על ידי כמות המוגלובין שמדמם לתוך המלח. הליך מהיר ופשוט יחסית זה גורם לדימומים עקביים הניתנים לשחזור. בהשוואה למודל ההישרדות של TVT, הוא משתמש בהליך הומני יותר מבלי לפגוע ברגישות להתערבות פרמקולוגית. יתר על כן, ניתן להשתמש בשני המינים, מה שמקטין את המספר הכולל של בעלי החיים שיש לגדל, תוך שמירה על עקרונות ה-3R’s. מגבלה פוטנציאלית במודלים של דימום היא האופי הסטוכסטי של המוסטזיס, אשר יכול להפחית את יכולת השכפול של המודל. כדי להתמודד עם זה, הפרעה ידנית לקריש מוודאת שהקריש מאותגר במהלך הניטור, ומונעת מהמוסטזיס ראשוני (טסיות דם) לעצור את הדימום. תוספת זו לקטלוג מודלים של פציעה מדממת מספקת אפשרות לאפיין השפעות פרו-קרישיות באופן סטנדרטי והומני.

Introduction

מודלים של בעלי חיים חיוניים להבנת הפתוגנזה של המופיליה ולפיתוח ובדיקה של משטרי טיפול וטיפולים. עכבר הנוק-אאוט פקטור VIII (F8-KO) הוא מודל נפוץ לחקר המופיליה A ^1,2. עכברים אלה מסכמים תכונות מרכזיות של המחלה ונמצאים בשימוש נרחב לפיתוח טיפולים, כגון מוצרי FVIII רקומביננטיים ^3,4,5 ואסטרטגיות ריפוי^{גנטי 6,7}.

ישנם מודלים שונים של פציעת דימום להערכת ההשפעות הפרמקולוגיות של תרכובות המוסטטיות שונות in vivo. אחד ממודלים אלה של קרישה הוא מודל ההישרדות של טרנסאקציה של ורידי זנב בעכברים 8,9,10,11,12,13,14, המודד את יכולתם של עכברים המופיליים לשרוד אקסנגווינציה לאחר טרנסקציה של הזנב. שיטה זו הוצגה לפני יותר מארבעה עשורים לפני¹⁵ ועדיין נעשה בה שימוש ^9,16,17. עם זאת, המודל מנצל את ההישרדות כנקודת קצה ודורש תצפית על בעלי החיים במשך תקופה של עד 24 שעות, שבמהלכה בעלי החיים בהכרה ולכן יכולים לחוות כאב ומצוקה.

מודלים של דימום של משך זמן קצר יותר ותחת הרדמה מלאה תוארו בעבר, כגון מודל קליפ הזנב (הידוע גם בשם קצה הזנב)8,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28 . עם זאת, לצורך נורמליזציה מלאה של אובדן הדם לאחר אתגר הדימום, מודלים אלה דורשים מינונים של תרכובות פרו-קרישיות (למשל, FVIII) גבוהות בהרבה מאלו שניתנו קלינית²⁹. מודל פציעה אחר בהרדמה, שיטת הדימום של הווריד saphena, רגיש למינונים נמוכים יותר של תרכובות פרוקו-קרישיות³⁰ אך דורש רמה גבוהה של התערבות נסיינית מכיוון שיש לשבש את הקרישים לעתים קרובות (בניגוד ל-3 פעמים במודל המוצג).

סטנדרטיזציה לקראת פרוטוקול משותף לבדיקת תרכובות פרוקו-קרישיות חדשות תקל מאוד על השוואת נתונים בין מעבדות 31,32,33. במודלים של TVT, אין עדיין הסכמה משותפת על נקודות קצה שנחקרו (איבוד דם ^7,26, זמן דימום ^9,34 ושיעור הישרדות^35,36), ואורך הניסוי משתנה בין מחקרים¹³.

המטרה העיקרית שלנו היא לתאר ולאפיין מודל אופטימלי עם יכולת שכפול גבוהה, את האפשרות ללמוד לפי דרישה כמו גם טיפול מניעתי, רגישות להתערבות פרמקולוגית המקבילה למודל ההישרדות, אך לא להשתמש במוות או כמעט מוות כנקודות קצה. על מנת להפחית את הכאב והמצוקה, בעלי החיים לא צריכים להיות בהכרה במהלך הדימום ויש ליישם נקודת קצה אתית יותר³⁷.

דגמי קליפס זנב נערכים בדרך כלל באחת משתי גרסאות, או קטיעת קצה הזנב, למשל, קטיעה של 1-5 מ”מ 18,19,20,20,21,23,24 או, בגרסה חמורה יותר, קטיעת קוטר זנב סביב 1-3 מ”מ ^8,22,25 . זה גורם לדימום עורקי משולב, שכן הוורידים הצדדיים והגבריים והעורק הגחוני מנותקים בדרך כלל, ובאופן כללי, ככל שהקטיעה גדולה יותר, כך הרגישות לתרכובת פרוקו-קרישית נמוכה יותר. יתר על כן, מכיוון שקצה הזנב נקטע, הפגיעה העורקית נחשפת ללא כל רקמה מנוגדת; לכן, לפחות בתיאוריה, הוא שונה מהדימומים ההמופיליים הנפוצים ביותר.

כפי שהשם מרמז, רק הווריד נפגע במודלים של טרנסקציה של וריד זנב כמו המתואר במאמר זה, וכתוצאה מכך נוצר דימום ורידי בלבד. מכיוון שהכלי אינו מנותק לחלוטין, הפציעה צפויה להיות קטנה יותר מאשר במודלי הקטיעה, והרקמה סביב החתך, שקריש עשוי לדבוק בה, נשמרת. בנוסף, יש לחץ דם נמוך יותר בווריד לעומת העורק. גורמים אלה תורמים לרגישות מוגברת ביחס למודלים של קטיעה, כך שניתן להשיג נורמליזציה של דימום עם מינונים רלוונטיים מבחינה קלינית של טיפול חלופי, למשל, עם rFVIII בהמופיליה A, אשר שימושי להערכת הגודל והעמידות של ההשפעות של טיפול פרוקו-קרישי 26,38,39.

Protocol

כל הנהלים המתוארים בפרוטוקול זה אושרו על ידי הגוף לרווחת בעלי חיים ב- Novo Nordisk A/S, והפיקוח הדני על ניסויים בבעלי חיים, משרד המזון, החקלאות והדיג הדני. שיטת 40 הדקות הממוטבת כוללת הרדמה וזמן מינון בתכנון (איור 1). עכברים המופיליים משני המינים בין 10-16 שבועות נדרשים להליך זה. <p class=…

Representative Results

כדי להעריך את הישימות של המודל הממוטב, בוצע מחקר בעכברי F8-KO (רקע גנטי C57BL) שניתנו עם טיפול חלופי של גורם רקומביננטי VIII הזמין מסחרית (rFVIII); נבדקו ארבעה מינונים שונים: 1 IU/kg, 5 IU/kg, 10 IU/kg ו-20 IU/kg. יתר על כן, בדקנו את בקרת הרכב המתאימה (שלילית) בעכברי F8-KO ובקבוצות מסוג פרא (WT) תוך שימוש בעכברי C57BL כקבוצת ב?…

Discussion

לשיטה אופטימלית זו של טרנסקציה של ורידי זנב (TVT) יש מספר יתרונות בהשוואה לשיטת ההישרדות של TVT. בעלי החיים מורדמים לחלוטין במשך כל משך המחקר, מה שהופך את הטיפול בעכברים לקל יותר ומגביר את רווחת בעלי החיים. יתר על כן, בניגוד למודל ההישרדות של TVT, אין צורך בתצפית לילה, ומודל מותאם זה מציע את האפשר?…

Materials

#11 Scalpel blade	Swann-Morton	503
15 mL centrifuge tubes	Greiner Bio-One, Austria	188271
30 G needles connected to 300 µL precision (insulin) syringes for dosing	BD Micro-Fine + U-100 insulin syringe	320830
Advate	Takeda, Japan		Recombinant factor VIII replacement therapy (rFVIII)
Alcohol pads 70% ethanol	Hartmann, Soft-Zellin	999 979
Centrifuge	Omnifuge 2.0 RS, Heraus Sepatech
Cutting template (Stainless steel)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 2: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 3 mm depth and 3 mm width; radius 1.5 mm
Erythrocytes (RBC) lysing solution	Lysebio, ABX Diagnostics	906012
Gauze
Haematological analyser	Sysmex	CT-2000iv
Heating lamp on stand	Phillips	IR250
Heating pad with thermostat	CMA	model 150
Hemoglobin standards and controls – 8.81 mmol / l batch dependent	HemoCue, Denmark	HemoCue calibrator, 707037	Standards and controls are made from 2 different glasses of HemoCue calibrator. The value is determined against the International Reference Method for Hemoglobin (ICSH).
Isofluorane anaesthesia system complete with tubes, masks and induction box	Sigma Delta Dameca
Isoflurane	Baxter	26675-46-7
Magnifier with lights	Eschenbach
Measuring template (Aluminum)	Self produced, you are welcomed to contact the authors for the exact drawings		Supplementary Figure 1: Size specifications: 20 mm x 40 mm x 10 mm (L x B x H). Groove: 2.5 mm depth and 2.5 mm width; radius 1.25 mm
Micropipettes + tips	Finnpipette
Photometer	Molecular Devices Corporation, CA, USA	SpectraMax 340 photometer
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA	Version 9.0.1
Saline 0.9% NaCl	Fresenius Kabi, Sweden	883264
Special tail marker block for TVT tail cut
Tail holder
Vacuum liquid suction	Vacusafe comfort, IBS
Waterbath and thermostat	TYP 3/8 Julabo