이 문서에서는 미토타임제 생체 센서가 장착된 성상세포 배양의 미토콘드리아 타임랩스 이미징 방법과 미토콘드리아 역학, 이동성, 형태, 생물 발생, 레독스 상태 및 회전율의 결과다발성 분석을 설명합니다.
신경 수준에서 미토콘드리아 변경에 많은 주의를 기울였지만, 최근의 증거는 성상세포에서 미토콘드리아 역학및 기능이 인식에 연루되어 있음을 보여줍니다. 이 문서는 미토콘드리아 바이오 센서가 장착된 성상세포 배양의 시간 경과 이미징 방법인 미토타임에 대해 설명합니다. MitoTimer는 미토콘드리아 역학, 이동성, 형태학, 생물 발생 및 redox 상태를 평가하는 강력하고 독특한 도구입니다. 여기서, 문화, 이미지 수집 및 후속 미토콘드리아 분석을 위한 상이한 절차가 제시된다.
성상 세포는 뇌 항상성의 유지 보수에 중요한 선수입니다. 그들은 아마도 가장 잘 뇌에 중요 한 구조적 역할을 가지고 알려져 있다, 혈액-뇌 장벽의 일환으로1 그리고 뇌 에 걸쳐 뉴런과 시 냅 스를 지원 하 여2. 뉴런의 성상세포 지원은 구조적3및 대사4,5,성상세포가 신경 발생및 시냅토 발생을 촉진하는 동시에 활성 뉴런4,6,7에젖산염과 같은 주요 대사산물을 제공한다. 구조적 지원의 역할을 넘어, 성상세포는 Ca2+ 신호 및 버퍼링(자발적인 미토콘드리아 Ca2+ 유입 포함)8,9,K+ 버퍼링10에참여하는 활성 세포이며, 부상11, 12의시간에 뇌의 요구에 적응하고 반응할 수있습니다. . 이러한 동적 세포이기 때문에 성상 세포는 효율적인 미토콘드리아 네트워크가 필요한 강력한 에너지 요구 사항을 가지고 있습니다. 이러한 미토콘드리아는 또한 과도한 반응성 산소 종(ROS)13을완충하는 데 중요한 역할을 한다. 미토콘드리아는 에너지 생성 및 ROS 버퍼링의 개인 또는 로컬 역할 외에도네트워크(14)로기능한다. 이러한 의미에서, 그들은 각각15의새로운/감소된 미토콘드리아 및 더 오래/산화된 미토콘드리아를 나타내는 핵분열과 융합 미토콘드리아 사이의 평형을 유지한다. 세포의 전반적인 레독스 상태는 미토콘드리아 네트워크의 레독스 상태에 의해 측정될 수 있다. 병리학에서, 이것은 어떤 세포가 최적으로 작동하지 않을 수 있는지에 빛을 비출 수 있는 중요한 정보 입니다.
최근 몇 년 동안, 많은 센서는 세포에서 미토콘드리아의 역학과 기능을 연구하기 위해 개발되었습니다. 예를 들어, 에너지 교환(ATP), 레독스 상태(NADH/NAD+,ROS) 및 효소 기능(cAMP, Ca2+,Zn2+)을측정하는 센서는 현재 미토콘드리아기능(16)의연구에 사용되고 있다. 그 중에서도 미토타임러는 미토콘드리아 형태(크기, 모양, 표면적), 이동성(속도, 변위), 역학(융합 및 분열 이벤트) 및 전체 미토콘드리아 이직률 및 레독스 상태의 변화를 따를 수 있도록 허용합니다. 미토타이머는 돌연변이 적색 형광 단백질, drFP58317,인간 시토크롬 c 산화제18의아단위 VIII로부터 미토콘드리아 신호를 가지고있으며,19는 새로 합성된 미토콘드리아를 녹색(488 nm)과 산화미토콘드리아(555nm)로 시각화한다. 그린(488nm)과 적색(555nm) 형광비를 사용하면 개별 미토콘드리아, 형태 분석, 융합/핵분열 이벤트 및 레독스 상태 기록20,21의동시 평가를 허용한다. 이 독특한 속성미토콘드리아의 생리적 및 병리학 적 역할에 관한 많은 과학적 질문을 조사하는 데 사용할 수 있으며, 따라서 많은 다른 세포 유형 내에서 미토콘드리아 역학의 기본 메커니즘을 공개하기위한 매우 유망하다.
최근에는 시험관 내 성상세포와 생체내22에서미토콘드리아의 다이나믹하고 기능을 연구하기 위해 새로운 렌즈티바이러스 벡터(LV-G1-MitoTimer-MiR124T)를 개발했다. LV-G1-MitoTimer는 이전에 설명된 miR124T 뉴런 탈타겟팅시스템(23)과결합된 B3 증강제(gfaABC1D(gfaABC1D(GfaABC1D(B3)를 통해 신경교 피성 산성 단백질(GFAP) 프로모터 gfaABC1D의 잘린 버전을 사용한다. 시험관 내 및 생체 내 성상세포에서 미토콘드리아 바이오 센서를 단독으로 발현할 수 있다. 여기에 쥐 해마 성상세포의 문화를 수행하고 LV-G1-MitoTimer 바이오 센서를 장착하는 다른 단계뿐만 아니라 몇 시간 / 일 동안 성상 세포 미토콘드리아의 행동을 따르는 다른 현미경 단계입니다.
여기서, 배양된 성상세포에서 미토콘드리아 시스템의 역학 및 회전율을 세로적으로 따르는 새로운 방법이 제안된다. 한 번에 정해진 세포 또는 하나의 개별 세포(문헌에서 가장 자주 사용되는)24,25에대한 시간 경과접근법과는달리, 연구자들은 동일한 개별 세포에서 며칠 동안 미토콘드리아 시스템의 진화를 따를 수 있다. 높은 수준의 광 노출이 요구되고 많은 개별 세포의 선택이 덜 실현 가능한 단일 웰 라이브 이미징과는 달리, 제안된 방법은 이 현미경의 능력을 활용하여 우물의 다른 영역에서 여러 가지 세포를 이미지화하고 다양한 시간에 동일한 세포로 돌아와 다시 이미지화합니다. 관심있는 각 세포에 대해 측정 된 각 기준에 대해 수행 된 기준선으로 의 정상화 덕분에 미토콘드리아 시스템의 복잡성을 고려하고 자체 기준선 이미지에 비해 각 세포에 대한 치료 효과를 조사합니다. 한 번에 최대 16개의 우물에서 이러한 유형의 이미징을 자율적으로 수행하는 현미경의 능력은 미토콘드리아 시스템의 이질성을 다른 날에 이미징과 함께 제공되는 실험 적 가변성 없이 분석 중에 적절히 고려할 수 있게 합니다.
배양의 질, LV-G1-MitoTimer 바이오 센서를 표현하는 바이러스 감염의 수준, 현미경 및 목표의 종류 및 적합한 세포의 선택은 이 프로토콜에서 가능한 한 일관되게 유지되어야 하는 중요한 변수입니다. 세포 밀도, 벡터 의 유형 및 바이러스 성 타이터는 질문에 따라 적응 될 수 있습니다. 이전 연구는 LV-G1-미토타임발이 미토콘드리아기능 및역학(21,22,26,27)에해로운 결과를 초래하지 않는다는 것을 나타내지만, 농도가 세포에 대해 독성이 없음을 확인하는 것이 필수적이다(예를 들어, 제어되는 세포의 총 수를 잘 확인). 단일 초점 평면이 사용되는 바와 같이, 성상 세포는 가능한 한 평평하게, (2) 다른 라벨이 붙은 세포로부터 분리되어야 한다(접시에 있는 변위시 분석을 단순화하기 위해), (3) 높은 형광 수준을 갖는다. 배양에 있는 세포가 형태학에서 높게 가변할 수 있기 때문에, 미토콘드리아 시스템은 높게 이질적일 수 있습니다. 이러한 맥락에서, ROI를 분석(전체 셀이 아님)은 페리핵 지역과 같은 일부 문제가 되는 지역을 보상하고 변동성을 감소시다. 비교적 유사한 세포에 기준선을 하고 가능한 한 많은 세포를 샘플링하는 것이 필수적입니다. 따라서 높은 콘텐츠 획득 및 분석 현미경이 이상적입니다. 이 세로 모니터링 하는 동안, 바이오 센서 표백을 피하기 위해 빛에 세포를 과열 하지 않는 것이 중요 하다.
이 이미징 방법은 복잡성이 없는 것이 아니며 프로토콜 전반에 걸쳐 현미경으로 이전 테스트 중에 수행된 문제 해결을 고려하는 여러 메모가 포함되어 있습니다. 예를 들어, 사용되는 플레이트 코팅의 선택은 의도된 분석서에 따라 다르지만, 성상세포 1차 배양에 가장 적합한 선택에 대한 권장 사항이 포함되어 있다. 또한, 세포간 가변성으로 인해 조건당 최소 5개의 세포에서 이미지 수집을 수행해야 합니다. 보다 구체적으로, 베이스라인 이미징에서 선택된 일부 세포는 죽고, 일부는 할당된 이미지 획득 영역의 프레임밖으로 이동하고, 일부는 그들의 형태를 변화시켜 미토콘드리아가 분석에서 개별화하기가 매우 어려워집니다. 처음부터 많은 세포를 이미징하여 실험이 끝날 때 분석하기에 충분한 양의 세포 크기가 증가할 가능성을 높입니다. 이 화상 진찰 기술의 더 복잡한 양상 이외에, 화상 진찰 및 분석의 이 모형에서 유익할 수 있는 한 몇몇 명백한 한계가 있습니다. 이미지 수집의 자동화를 최대한 활용하기 위해 사용되는 현미경은 이미지(즉, 이 프로토콜의 3초마다)사이의 시간 간격 속도를 처리할 수 있는 자동 초점 시스템을 가져야 하며 각 이미지를 촬영하기 전에 문제의 셀에 일관되게 집중할 수 있습니다. 또한 전체 이미지 수집 프로세스를 자동화하는 JOBS 소프트웨어가 없으면 이 방법은 적절한 시점에서 각 셀을 수동으로 찾고 이미징해야 하므로 이미지되는 셀 수에 따라 힘들고 잠재적으로 불가능해집니다. 마지막으로, 이 이미징 방법은 광표백 문제에 면역이 되지 않습니다. 이러한 이유로, 어떤 장기 취득 방법과 마찬가지로, 광표백에 덜 취약한 형광 마커를 선택하고 가능한 한이 문제를 피하기 위해 이미지 수집을 조정하는 것이 중요합니다.
이 기술은 현재 중요한 방법으로 사용되는 다른 사람과 다릅니다. 다른 시간 경과 연구와는 달리,이 기술은 전체 시간에 동일한 위치에 이미징을 필요로하지 않으며, 다른 영역을 이미지플레이트의 수동 이동을 필요로하지 않습니다. 이것은 연구원이 1개의 24 시간 기간에 있는 많은 조건에서 많은 세포를 심상하는 기능을 허용합니다. 따라서, 각 우물의 많은 세포에 대한 이 이미징 및 분석을 수행하는 능력은 이미지된 각 세포로부터 특정 측정을 추가로 제공하면서 큰 세포 그룹을 광범위하게 연구하여 얻을 수 있는 동일한 인구 정보를 제공합니다. 이 방법에 대한 몇 가지 구체적인 내용은 다른 이미지 수집 방법(위에 설명된 참조)에 적용되지 않을 수 있지만, 이점은 획득 후 가능한 분석 유형의 합병증보다 큽니다. 이 기술은 연구원이 미토콘드리아 시스템에 각종 처리의 정확한 파급효과를 볼 수 있고, 결과적으로, 배양한 성상세포에 있습니다.
추가적으로, 이 방법은 특정 맥락에서 미토콘드리아 행동 및 역할에 관하여 많은 다른 과학적 질문에 높게 사용자 정의할 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 배양 성상 세포와 구체적으로 다룹니다. 그러나, 많은 그밖 세포 모형을 이용될 수 있고, 시험될 수 있는 처리는 조사되는 질문에 의해서만 제한됩니다. 화상 진찰의 이 모형은 미토콘드리아 행동의 집단적인 지식과 이해를 발전시킬 가능성이 있습니다, 미토콘드리아 기능 장애로 이끌어 내는 근본적인 기계장치, 및 세포의 다른 모형에 존재하는 타고난 역학에 많은 병학의 효력.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 K.R. 및 로잔 대학 병원 (CHUV)에 수여 시냅시스 재단 펠로우십에 의해 지원되었다. 저자들은 니콘의 도움, 특히 J. Gannevat에게 감사를 표합니다.
µ-Slide 8 Well | IBIDI | 80807 | |
19 G needle | Plexus SANTE | PL001213 | |
21 G needle | Plexus SANTE | PL000142 | |
25 G needle | Plexus SANTE | PL000133 | |
Bovin Serum Albumin | LIFE TECH | 15260037 | |
Camera | HAMAMATSU | ORCA-flash4.0 V3 – C13440-20CU | |
DMEM, high glucose, GlutaMAX(TM) | THERMOFISHER | 61965059 | |
Glutamax Supplement | THERMOFISHER | 35050061 | |
Horse Serum | SIGMA | 16050122 | |
Lens | Nikon Instruments | CFI Plan Fluor 100x Oil | |
Light Engines | LUMENCOR | SPECTRA X | |
Linear-encoded motorized platine | Nikon Instruments | N/A | |
Microscope | Nikon Instruments | ECLIPSE Ti2-E MICROSCOPE INVERSE | |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | |
PBS 1x liquid | THERMOFISHER | 20012068 | |
Penicillin-Streptomycin | SIGMA | 15140122 | |
Petri dishes 100 mm | SIGMA | P5731 | |
Petri dishes 35 mm | SIGMA | CLS430165 | |
Pregnant Rats | CHARLES RIVERS | 3 | |
Software Nikon NIS-HC | Nikon Instruments | NIS-Elements HC | |
Sofware Prism | GraphPad | V8.02 | |
Stericup 500 mL | MERCK MILLIPORE | 10412701 |