该协议引入了元条形码分析的步骤,靶向16S rRNA和18S rRNA基因,用于监测海水样品中的有害藻华及其相关微生物组。它是一个功能强大的基于分子的工具,但需要几个程序,在这里逐步直观地解释。
有害藻类大量繁殖(HABs)监测已在全球范围内实施,智利是一个以渔业和水产养殖而闻名的国家,几十年来一直为此目的密集使用显微镜和毒素分析。分子生物学方法,如高通量DNA测序和基于细菌组装的方法,刚刚开始在智利的HAB监测中引入,并且程序尚未标准化。在这里,逐步介绍了用于监测智利HAB的16S rRNA和18S rRNA元条形码分析。根据最近的一项假设,藻类 – 细菌互利关联在水华开始,维持和回归方面起着关键的协同或拮抗关系。因此,从藻类细菌的角度监测HAB可以提供对HAB机制的更广泛理解和早期预警的基础。元条形码分析是最适合用于此目的的基于分子的工具之一,因为它可以检测样品中的大量藻类细菌分类信息。本文中从采样到元条形码分析的可视化程序提供了具体的说明,旨在减少错误和收集可靠的数据。
已知许多海洋浮游植物物种会产生内源性毒素,当这些物种积累足够数量时,它们对海洋环境有害。这种有害藻华(HABs)今天在世界大多数大陆的海岸上被观察到1。有毒的浮游植物首先在双壳类组织中积累,导致包括人类在内的更高营养水平的生物在消化时患病和死亡。随后,这些事件对当地经济,社会经济和公共卫生产生了严重影响2。据估计,HABs每年对全球经济造成的损害为数百万至数十亿美元3。智利是经常遭受有害藻华的许多国家之一。
智利是一个长国,南北绵延4,300多公里。细长的西部陆地面向太平洋,这自然增加了智利经历HAB的机会。特别是在智利南部,有许多世界著名的鲑鱼养殖,每次该地区发生HAB时,藻类毒素都会导致大量养殖鲑鱼生病并死亡4,5,6。在智利,HAB对经济打击最严重的一年是2016年,估计每年损失8亿美元7,8。致病性有毒藻类因年份和地点而异。对于2016年的病例,亚历山大卡塔内拉和疣假单胞菌的复合体在智利南部沿海大部分地区引起广泛的HAB7,8。智利最近的HAB发生在2021年3月在智利南部的Camanchaca的Heterosigma Akashiwo的致病藻类物种中,该地区有一个大型鲑鱼养殖场。
智利多年来一直使用两种主要方法进行沿海监测;用显微镜观察海水,定期识别有毒藻类物种,并通过生化测定法测量贝类中的毒素水平9。早期发现贝类中的有毒藻类和毒素水平并不能预防有害藻类;然而,这些分析可以立即引发对策,并减少对当地社区的损害。为了进一步加强该策略的有效性,我们最近在传统的智利HAB监测计划中增加了一种基于分子的分析方法,以检测海水样品中的藻类和相关细菌群落。具体而言,选择了一种使用元条形码的大规模并行测序方法,靶向16S rRNA和18S rRNA基因。虽然这种技术需要复杂的程序和昂贵的机械和试剂,但它是一种先进的技术,可以同时检测海水样品中存在的数千种藻类和细菌属/种。
HAB的原因推测是多种多样的,例如温度和季节,但不可能一概而论。这是因为HAB物种和频率取决于区域和时空条件,涉及自然现象,例如地理独特性,上升流营养混合以及由于错误2,10,11,12而从陆地产生的元素径流。此外,富营养化等人为因素影响局部HAB12,13。由于复杂的多因素,做出准确的HAB预测并不容易。近年来,有一种观点认为,特定的细菌种群可能与HAB的发展有关,作为因素之一,支持这一假设的研究已经越来越明显14,15,16,17,18。分子生物学技术通常用于研究细菌组装;然而,这种标准化的方法尚未在智利建立HAB监测9。为了研究藻类细菌与有害藻类的关联,必须同时对当前的智利沿海监测计划进行元条形码分析。因此,该协议直观地介绍了我们的智利HAB监测程序,重点是使用元条形码分析分析海水样品中藻类和细菌种类检测的逐步程序。
描述我们的智利HAB监测计划的完整协议可在Yarimizu等人9中找到。它包括海水采样,微观藻类物种检测,藻类细菌基因检测,色素分析,气象数据收集以及物理和化学水性质测定的程序。用于藻类和细菌物种检测的16S rRNA和18S rRNA元条形码分析的逐步方案可作为预印本19提供。该协议特别展示了元条形码分析步骤,因为它是我们HAB监测程序中最复杂的部分和亮点。该协议还包括引入程序和藻类物种的显微镜检测。当通过元条形码分析藻类物种时,同时进行显微镜检查以验证两种方法的结果至关重要。此协议不包括如何使用软件进行分类分配,但数据库建议将在下一节末尾简要说明。
该协议成功进行了18S rRNA和16S rRNA基因元条形码分析,以鉴定海水样品中的藻类和细菌物种,以监测智利HABs。该协议检测到的显性藻类和一些次要藻类与通过显微镜获得的藻类一致,证实了该协议的可靠性。该协议的亮点是,该分析从Metri的海水中检测到Alexandrium spp.和Pseudochattonella spp.,这是智利南部引起HAB的两种最有问题的物种,即使在低丰度下也是如此。特别是假单胞菌属。在显微镜下识别具有挑战性的物种,因为细胞很小,在光下或使用固定剂很容易破裂27,28。元条形码可以提供藻类物种信息,这些信息在海水样品中很少存在,显微镜无法识别。该协议还检测到30多种细菌物种。虽然这些细菌如何与藻类生长有关目前尚不清楚,但在时间序列分析中收集藻类细菌种类的大量数据可能会提供如此重要的发现。因此,在传统的智利HAB监测计划中增加元条形码分析无疑将加强目前的HAB监测效率。事实上,这种用于元条形码分析的视觉方案不仅有利于智利水的藻类细菌监测,而且有利于全球其他受HAB影响地区的海岸监测计划。
尽管该协议提供了上述优点,但应讨论该方法的缺点。如视觉协议所示,元条形码方法耗时且复杂,需要昂贵的机械和试剂。实验室人员必须经过专门培训,否则会浪费材料,劳动力和时间。此外,通过元条形码进行的藻类检测必须与显微镜配对,以验证从两种正交方法中鉴定出相同的优势物种29。显微镜是一种非侵入性工具,在大多数情况下,用于识别藻类物种,这意味着当藻类物种具有独特而明显的形状时,更难犯错误。当然,如果物种彼此具有非常相似的形状,则可能会发生人为错误。另一方面,由于元条形码分析需要多个步骤,因此自然会增加错误。它可能是样品混淆,错误的试剂添加或缺少某些程序。因此,将元条形码结果与通过显微镜获得的结果进行比较至关重要。最后,该协议仅在定性上适用,并且必须计算结果的相对丰度。正如Lamb等人在2019年所说,目前的元编码作为定量性能仍然有限,在元条形码可以自信地用于定量应用之前,还需要进行额外的研究30。
该协议针对Illumina Inc.发布的16S宏基因组测序文库制备手册中每次运行140 – 170个样本进行了优化。优化的协议经过多次测试,并进一步修改以发布此最终版本。因此,强烈建议精确地遵循每个步骤。该协议最关键的部分是需要格外小心以避免样品污染。移液器和层流罩必须始终用70%的酒精和紫外线清洗,并且应高压灭菌材料。在每次新运行时,应直接从原液中稀释引物和试剂,否则重复使用试剂并暴露于多个稀释液中可能会造成样品污染。该协议规定了何时可以在层流罩外完成操作。除非另有说明,否则样品应在清洁的层流罩中处理。当同时处理多个8管条带时,建议在第一个8管条带上工作,并在移动到下一个8管条之前将其盖上盖子。长时间打开盖子会导致样品污染,因为16S和18S rRNA基因在周围环境中高度普遍。所述时间(如混合时间和孵育时间)应严格按照描述进行,因为每个步骤的最佳持续时间是根据多次测试运行选择的。例如,时间过长或不足会降低样品产量。该过程应该仅在协议声明可以停止的部分停止。进行阴性控制至关重要,因为它确认阳性结果不是人为的假阳性。最后,强烈建议计划日期,因为它至少需要五天来处理所有步骤,并且某些部分在下一个停止标志之前无法停止。
这里简要指出了测序数据的分类分配的局限性。新发现的细菌和藻类的核苷酸序列每天都在数据库中更新。虽然经过充分研究的藻类和细菌物种被可靠地登记,但数据库中也更新了许多未知物种的序列。它表明,注册核苷酸序列的分辨率并不总是足以进行物种鉴定,而仅用于属鉴定。因此,微观物种鉴定必须正交进行。为这项工作建立开放获取管道在同时处理大量序列数据以及在发生错误时有效调查方面具有显着的优势。此外,DADA2 的输出位于文本或 csv 文件中,便于进一步进行统计分析。另一方面,需要大型服务器来执行分类分配,尤其是当数据集很大时。要设置管道,需要工程师来设置管道,专业人员必须了解参数,操作,Linux和生物信息学。
除了作为HAB监测工具的范围外,该协议的使用可以扩展到调查研究目的。例如,智利政府与当地渔民以及环境和平协会之间就当地HAB31,32的数量增加进行了持续的辩论。政府声称这是由于全球变暖和厄尔尼诺等自然现象造成的,而后来的各方则声称鲑鱼养殖是原因。鲑鱼不是智利的本土物种,半个世纪前也不在智利水域。当时的智利政府旨在通过发展鲑鱼业务来发展经济并为贫困地区创造就业机会33.随着海外对资本利润的干预,智利在围栏式水产养殖发展方面取得了巨大成功,鲑鱼的数量在过去几十年中显着增加31,32,33。随后,大量鲑鱼的食物被扔进海里,导致当地人怀疑鲑鱼养殖是当地HABs频繁的原因31、32.真相现在还不得而知,但最终必须理解,以便制定保护当地海洋环境,经济和人类健康免受HAB攻击的策略。对局部藻类 – 细菌关系的基于分子的分析可能有助于为此类主题向前迈进一步。例如,该技术可以搜索以前在目标海洋区域不存在但近年来急剧增加的藻类和细菌物种,这与Sakai等人通过GIS和eDNA分析34发现未记录的大和蝾螈(Hynobius vandenburghi)种群的研究有些相似。因此,除了HAB监测工具之外,这种元条形码协议还具有其他潜在客户的潜在用途。
The authors have nothing to disclose.
这项研究得到了赠款(JPMJSA1705)的支持,用于智利可持续发展监测藻类的科学和技术研究伙伴关系(SATREPS-MACH)的研究。我们感谢Sandra Rios博士(洛斯拉各斯大学)允许我们使用电影剪辑。我们感谢尼尔·安德鲁·霍兰德(Neal Andrew Holland)对手稿的勤奋校对。我们衷心感谢智利蒙特港CREAN-IFOP实验室小组成员就浮游植物鉴定向我们提供建议。
1.5 mL single tube | ThermoFisher | Q32856 | sterile |
1.5 mL tubes | ThermoFisher | 2150N | sterile |
8-strip 0.2 mL PCR tubes and flat cap | ThermoFisher | AB0451 & 4323032 | sterile |
96-well 0.2 mL PCR plate | ThermoFisher | N8010560 | |
AccuRuler 100 bp DNA Ladder | MaestroGen | 02001-500 | |
Chelex 100 Chelating Resin | Bio-Rad | 1432832 | |
Chemical Duty Vacuum Pressure Pump | MilliporeSigma | WP6122050 | |
D1000 Reagents | Agilent Technologies | 5067-5583 | |
D1000 sample buffer | Agilent Technologies | 5067-5602 | |
DNA loading dye (Blue/Orange Loading Dye 6X) | Promega | G1881 | |
Ethanol Molecular Biology Grade | E7023 | Merck KGaA | |
Filtration device | ThermoFisher | 09-740-36H, 09-740-23E | |
Fluorescent DNA concentration measurement kit (Qubit dsDNA HS Assay kit) | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | |
Fluorometer (Qubit4 Fluorometer) | ThermoFisher | Q33238 | |
Fragment analysis verification matrix (D1000 ScreenTape) | Agilent Technologies | 5067-5582 | |
Fragment Analyzer (Agilent Tapestation 4150) | Agilent | G2992AA | |
GelRed Nucleic Acid Gel Stain | Biotium | 41002 | |
Generic bench vortexer (Vortex Genie 2) | Scientific Industries | SI-0236 | |
Heat block | |||
High performance sequencing-grade DNA polymerase (KAPA HiFi Hotstart ReadyMix), 2X | Roche | KK2602 | |
HT1 Hybridization buffer | Illumina | 20015892 | |
Illumina Nextera XT v2 Index Kit set A, B, C and D | Illumina | FC-131-2001, -2002, -2003, -2004 | |
Laminar hood cabinet | Biobase Co. | Biobase PCR-800 PCR Cabinet | |
Loading tips (Specific for Agilent TapeStation systems) | Agilent Technologies | 5067-5598 | |
Magnetic beads DNA cleanup system (ProNex® Size-Selective Purification System) | Promega | NG2002 | |
Magnetic stand for 96 wells (Magnetic Stand-96) | ThermoFisher | AM10027 | |
Micro-seal film for 96-well plate | ThermoFisher | 4311971 | sterile |
MiSeq Reagent Kit v3 | Illumina | MS-102-3003 | includes pre-filled, ready-to-use reagent cartridges. |
MiSeq system | Illumina | SY-410-1003 | includes pre-installed software |
Molecular grade nuclease-free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-04 | |
Molecular grade sodium hydroxide (NaOH) 1M | Merck KGaA | 1091371000 | |
Multichannel pipettes | Not specified | Not specified | |
Multi-Purpose Agarose | Cleaver Scientific | CSL-AG500 | |
Ow D2 Wide-Gel Electrophoresis System | ThermoFisher | D2 | |
Ow EC-105 Compact Power Supply | ThermoFisher | 105ECA-115 | |
Pellet Pestle— Cordless Motor | ThermoFisher | K749540-0000 | |
PhiX control Kit v3 | Illumina | FC-110-300 | ready-to-use control library for Illumina sequencing |
Pipette tips | Not specified | Not specified | sterile |
Pipettes | Not specified | Not specified | 2, 10, 20, 100, 1000 μL |
SterivexTM GP 0.22 μm filter unit | MilliporeSigma | SVGP01050 | |
Tabletop centrifuge | Eppendorf 5427R Centrifuge | Eppendorf AG | |
TBE buffer | ThermoFisher | B52 | |
TE buffer (pH 8.0) | ThermoFisher | AM9849 | |
Terr PCR Direct FFPE Kit | Takara Bio USA | 639284 | includes 2X Terra PCR Direct Buffer |
Terra PCR Direct Polymerase Mix, 1.25 U/μL | Takara Bio USA | 639271 | High performance Inhibitor-tolerant DNA polymerase |
ThermalCycler (MiniAMP Plus Thermal Cycler) | ThermoFisher | A37835 | |
TransIlluminator and image capture system | Analytik Jena, AG | GelDoc-ItTS2 Imager | |
Whatman 1.0 m pore-sized membrane | MilliporeSigma | WHA111110 |