Bir Murin Arka Bacak Modelinde Arteriyogenez Sırasında Lökosit Alımını İzlemek için Multifoton İntravital Görüntüleme
Summary
Lökosit ve trombositlerin işe alınması, arteriyogenez sırasında kollateral arterlerin etkili büyümesi için gerekli olan önemli bir bileşeni oluşturur. Multifoton mikroskopisi, arteriyogenez sırasında lökosit alımını ve ekstravazasyonunu incelemek için in vivo yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe ve daha az foto-toksisiteye sahip hücre dinamiklerini izlemek için etkili bir araçtır.
Abstract
Arteriyogenez, büyüyen kollateral damarların perivasküler boşluğuna lökosit ve trombosit alımına güçlü bir şekilde bağlıdır. Arteriogenezde kollateral arterlerin ve lökositlerin analizinde standart yaklaşım ex vivo (immüno -) histolojik metodolojidir. Bununla birlikte, bu teknik kan akışı, kayma stresi, hücre-hücre etkileşimleri ve parçacık hızı gibi dinamik süreçlerin ölçülmesine izin vermez. Bu yazıda, intravital görüntüleme kullanılarak arteriyogenez sırasında büyüyen kollateral arterlerde in vivo süreçleri izlemek için bir protokol sunulmaktadır. Burada açıklanan yöntem, dinamik ölçüm için güvenilir bir araçtır ve çoklu foton uyarma mikroskobu tarafından sağlanan minimum foto-sitotoksisiteye sahip yüksek kontrastlı bir analiz sunar. Büyüyen kollateral arterleri analiz etmeden önce, femoral arterin tek taraflı bağlanması ile farelerin adduktör kasında arteriyogenez indüklendi.
Ligasyondan sonra, önceden var olan kollateral arterler, artan kayma stresi nedeniyle büyümeye başladı. Ameliyattan yirmi dört saat sonra, kollateral arterlerin üzerindeki deri ve deri altı yağları çıkarıldı ve daha ileri analizler için bir cep oluşturuldu. İn vivo görüntüleme sırasında kan akışını ve bağışıklık hücrelerini görselleştirmek için, CD41-floresein izotiyosiyanat (FITC) (trombositler) ve CD45-fikoeritrin (PE) (lökositler) antikorları, bir farenin kuyruk damarına yerleştirilen bir kateter aracılığıyla intravenöz olarak (i.v.) enjekte edildi. Bu makalede, arteriyogenez ile ilgili süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılan statik ex vivo (immüno-) histolojik analizlere alternatif veya in vivo kompleman olarak intravital multifoton görüntüleme tanıtılmaktadır. Özetle, bu yazıda immün hücre kaçakçılığını, kan akışını ve kayma stresini arka bacak arteriyogenez modelinde araştırmak için yeni ve dinamik bir in vivo yöntem anlatılmakta ve bu da değerlendirme olanaklarını önemli ölçüde artırmaktadır.
Introduction
Son yıllardaki yoğun araştırma ilgisine rağmen, kardiyovasküler hastalıklar, örneğin iskemik kalp hastalığı ve inme, hala önde gelen küresel ölüm nedenidir1. Bu hastalıkların güncel tedavileri perkütan transluminal anjiyoplasti, perkütan transluminal koroner anjiyoplasti veya bypass cerrahisi2 gibi oldukça invaziv tedavilerdir. Bu nedenle, alternatif, non-invaziv tedavi seçeneklerinin geliştirilmesine acilen ihtiyaç vardır. Vücut, kesilen kan akışını stenozun distal kısmına yönlendirmek için stenozlu veya tıkalı bir damarın etrafında doğal baypaslar oluşturabilir. Bu sürece arteriyogenez2 denir. Son zamanlarda yapılan birçok çalışma, artan sıvı kaymasının, arteriyogenez3 sırasında önemli bir rol oynayan lökosit alımını etkilediğini göstermiştir. Arteriyogenez sırasında lökositlerin işe alımını analiz etmek için ana güncel seçenekler ex vivo (immüno -) histolojik analizler veya floresan aktive hücre sıralama (FACS) metodolojisi4’tür. Arteriyogenez sırasında lökosit dinamiklerinin değerlendirilmesini sağlamak için, bu yazıda multifoton mikroskobu ile intravital bir görüntüleme protokolü sunulmaktadır.
Lökositler, arteriyogenez3 sürecinde işe alınan başlıca kan hücreleridir. Bu protokol, kollateral arterlerde enjekte edilen anti-CD45-PE antikorları ile etiketlenmiş yapışkan lökositlerin taranmasını, bir murin arka ekstremite iskemisi model 5,6 kullanılarak femoral arter ligasyonu (FAL) ile arteriyogenezin indüksiyonundan 24 saat sonra göstermek için multifoton görüntüleme kullanır. Alternatif olarak, bağışıklık hücreleri ex vivo olarak etiketlenebilir ve intravital mikroskopi7 kullanılarak anjiyogenez üzerine yapılan çalışmalarda gösterildiği gibi farelere dikkatlice enjekte edilebilir. Damarlar ve arterler içindeki kan akışı, CD41-FITC (trombositleri etiketlemek için), dekstran-FITC (plazma) veya vasküler ağacın bir kısmının bazal zarında bulunan kollajen tip 1’i görselleştiren ikinci harmonik nesil (SHG) ile görselleştirilebilir. SHG, çoklu foton uyarımının benzersiz bir serbest etiketleme etkisidir. Multifoton görüntüleme, dokuya zarar vermeden ve hücreleri lazer güç uyarımı ile aktive etmeden uzun süreli hücre takibine izin verir. Multifoton mikroskopisi, floroforları doku / organların derinliklerine minimum fototoksisite ile uyarma kabiliyeti nedeniyle canlı hayvanlarda floresan olarak etiketlenmiş hücreleri ve yapıları görselleştirmek için tercih edilen görüntüleme yöntemidir8.
Femtosaniye aralıklarla verilen darbelerle ayarlanmış kızılötesi lazerlerin kullanılması, florokromu yalnızca odak düzleminde heyecanlandırır, odak düzlemi8’in üstünde ve altında uyarma olmaz. Böylece, çoklu foton mikroskopisi, organların içindeki dinamik biyolojik olayları incelemek için yüksek uzaysal-zamansal çözünürlük, daha az foto-hasar ve artan doku penetrasyon görüntülemesine izin verir. Canlı hayvan görüntülemesi için ideal bir mikroskopi aracıdır. Bununla birlikte, multifoton ve diğer intravital mikroskopi sanatları, kalp atışı, solunum, peristaltik hareketler, kas tonalitesi ve görüntüleme edinimini ve analizini bozan diğer fizyolojik fonksiyonlar nedeniyle doku hareketi ile sınırlıdır. Bu hareketler zamansal ve mekansal çözünürlüğü bozduğundan ve hatta bazen sonraki analizleri yasakladığından, doğru veri analizi ve yorumlamasını sağlamak için uygun şekilde ele alınmaları gerekir. Doku hareketinden kaynaklanan artefaktları azaltmak veya önlemek için çeşitli stratejiler geliştirilmiştir. Bu protokol, görüntü alımı sırasında doku kaymasını düzeltmek için VivoFollow9 adlı bir yerinde sürüklenme düzeltme yazılımı uygular. Bu yaklaşım, gerekli görüntü sabitlemeyi sağlayarak uzun süreli görüntüleme ve hücre izleme analizine olanak tanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lökosit alımının tarif edilen multifoton in vivo analizi yöntemi, (immüno-) histolojik veya FACS analizleri gibi lökosit işe alım çalışmaları için yaygın olarak kullanılan araçlara bir eki temsil etmektedir. Bu görüntüleme yöntemi ile arteriyogenez10 sırasında lökosit aderansı ve ekstravazasyonundaki dinamik süreçleri daha ayrıntılı olarak görselleştirmek mümkündür. Bu yöntemin katma değerine rağmen, sunulan protokol bazı kritik adımlar ve sınırla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 914 (HI-A / SM, proje Z01) tarafından finanse edildi. Dr. Susanne Stutte’ye makaleyi okuduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| 1.0 mL Syringe | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 309628 | syringe for injection |
| 3M Durapore Surgical Tape 1538-0 | 3M, St. Paul, MN, USA | 1538-0 | fixation tape |
| Atipamezole | Zoetis, Berlin, Germany | antagonize anesthesia | |
| Buprenorphine | Reckitt Benckiser Healthcare, Slough, UK | antagonize anesthesia | |
| C57/B6J mouse | Charles River, Sulzfeld, Germany | used animals for surgery/imaging | |
| CD41-FITC ab | Biolegend | 133904 | Platelet labeling in vivo |
| CD45-PE ab | Biolegend | 368510 | Leukocytes labelling in vivo |
| Disinfectant Cutasept | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Deutschland | AK64.2 | Disinfection |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 5g | |
| Fentanyl | CuraMED Pharma, Karlsruhe, Germany | anesthesia | |
| Flumazenile | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Fine bore polythene tubing | Smiths medical | Lot 278316 | 0.28 mm ID and 0.61 mm OD, tubing for the vein catheter |
| Histoacryl flexible | BRAUM | 1050052 | tissue glue |
| Imaris software | Oxford Instruments | version 9.2 | Used for cell tracking, cell speed analysis, 3D projection |
| Laser Doppler Imaging instrument | Moor LDI 5061 and Moor Software Version 3.01, Moor Instruments, Remagen, Germany | ||
| LEICA KL300 LED | Leica, Solms, Germany | light for microscope | |
| Leica M60 | Leica, Solms, Germany | microscope for surgery | |
| LEICA MC120 HD | Leica, Solms, Germany | camera for microscope | |
| Medetomidine | Pfizer Pharma, Berlin, Germany | anesthesia | |
| Midazolam | Ratiopharm GmbH, Ulm, Germany | anesthesia | |
| Multiphoton microscope | Lavision | TRIMScope II | WL 820 nm |
| NaCl 0.9% | Braun, Melsungen, Deutschland | 3570310 | saline for pocket |
| Naloxone | Inresa Arzneimittel GmbH, Freiburg, Deutschland | antagonize anesthesia | |
| Needle 30 G | BD Biosciences, San Jose, CA, USA | 305128 | needle for i.v. catheter |
| Silk braided suture (0/7) | Pearsalls Ltd., Taunton, UK | SUT-S 103 | suture for femoral artery ligation |
| Ultrason Gel | SONOSID-ASID BONZ 250 mL | 782012 | gel for imaging |
| Vicryl 6.0 suture | Vicryl, Johnson&Johnson, New Brunswick, NJ, USA | NW-2347 | suture to build pocket |
| VivoFollow drift correction software | Developed by Mykhailo Vladymyrov | Reference 9 |
References
- The top 10 causes of death. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death (2020)
- Deindl, E., Schaper, W. The art of arteriogenesis. Cell Biochemistry and Biophysics. 43 (1), 1-15 (2005).
- Lasch, M., et al. Extracellular RNA released due to shear stress controls natural bypass growth by mediating mechanotransduction in mice. Blood. 134 (17), 1469-1479 (2019).
- Kumaraswami, K., et al. A simple and effective flow Ccytometry-based method for identification and quantification of tissue infiltrated leukocyte subpopulations in a mouse model of peripheral arterial disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (10), 3593 (2020).
- Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54166 (2016).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737 (2009).
- Wagner, M., et al. Intravital microscopy of monocyte homing and tumor-related angiogenesis in a murine model of peripheral arterial disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (126), e56290 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. Advanced fluorescence microscopy techniques–FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).
- Vladymyrov, M., Abe, J., Moalli, F., Stein, J. V., Ariga, A. Real-time tissue offset correction system for intravital multiphoton microscopy. Journal of Immunological Methods. 438, 35-41 (2016).
- Chandraratne, S., et al. Critical role of platelet glycoprotein ibalpha in arterial remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (3), 589-597 (2015).
