Эксплантная система для покадровых исследований обонятельной кольцевой сборки у дрозофилы
Summary
Этот протокол описывает процедуру рассечения, состояние культуры и живую визуализацию системы эксплантов антенны-мозг для изучения сборки обонятельной цепи.
Abstract
Нейроны точно связаны между собой, образуя цепи, необходимые для правильного функционирования мозга. Обонятельная система Drosophila обеспечивает отличную модель для исследования этого процесса, поскольку 50 типов обонятельных рецепторных нейронов (ORNs) от антенн и верхнечелюстных пальпов проецируют свои аксоны на 50 идентифицируемых клубочков в антеннальной доле и образуют синаптические связи с дендритами из 50 типов проекционных нейронов второго порядка (PNs). Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на выявлении важных молекул, которые регулируют точное нацеливание в обонятельной цепи с использованием фиксированных тканей. Здесь описана эксплантная система антенны-мозг, которая повторяет ключевые вехи развития обонятельной сборки схем в культуре. Благодаря рассечению внешней кутикулы и очистке непрозрачных жировых тел, покрывающих развивающийся мозг куколки, высококачественные изображения отдельных нейронов из живого мозга могут быть собраны с помощью двухфотонной микроскопии. Это позволяет получать покадровую визуализацию одного аксона ORN из живой ткани. Такой подход поможет выявить важные клеточные биологические контексты и функции ранее идентифицированных важных генов и выявить механизмы, лежащие в основе динамического процесса сборки схем.
Introduction
Нейроны точно связаны между собой, образуя цепи, необходимые для правильной функции мозга. На протяжении более 100 лет нейробиологи пытались понять, как нейриты распространяются к своим промежуточным и конечным целям с предельной точностью. В результате они идентифицировали важные гены, которые кодируют направляющие сигналы для развития нейронных процессов1. Обонятельная система Drosophila обеспечивает отличную модель для исследования этого процесса, поскольку обонятельные рецепторные нейроны (ORN, первичные сенсорные нейроны) проецируются на 50 идентифицируемых клубочков со стереотипным размером, формой и относительным положением, где они образуют синаптические связи с дендритами из 50 типов проекционных нейронов второго порядка (PN), каждый из которых посылает дендриты в один из 50 клубочков2 (рисунок 1AA). ). Поэтому относительно легко идентифицировать мутантные фенотипы с синаптическим (клубочковым) разрешением в обонятельной системе мух. Это привело к открытию важных генов, которые регулируют обонятельную цепь сборки3.
Сборка обонятельной цепи мухи опирается на временно и пространственно скоординированные процессы развития3. ОРН и ПН приобретают различные судьбы ячеек, которые создают программу для их специфики проводки. Далее PN дендриты препастернируют антеннальную долю (рисунок 1B). Затем аксоны ОРН обходят ипсилатеральную антеннальную долю и пересекают среднюю линию мозга, чтобы достичь контралатеральной антеннальной доли. Впоследствии аксоны ORN вторгаются как в ипси-, так и в контралатеральные антеннальные доли и образуют синапсы с дендритами своих партнерских PNs в специфических клубочках. Эта грубая модель для сборки обонятельных схем была предложена на основе характеристики фиксированных образцов из промежуточных временных точек во время разработки. Плохое временное разрешение и неспособность следовать одним и тем же нейронным процессам на протяжении всего развития из фиксированной ткани ограничивают механистическое понимание процесса сборки схемы.
Технически сложно жить изображениями ORN и PN процессов in vivo, поскольку процесс проводки происходит в первой половине стадии куколки, когда антеннальная доля окружена непрозрачным жирным телом внутри корпуса куколки. Поэтому невозможно непосредственно изобразить развивающуюся обонятельную цепь из неповрежденных куколок. Рассеченные ткани, культивируемые ex vivo, могут обходить тканевую непрозрачность и были успешно использованы для изучения нейронного развития 4,5,6. Проблема использования аналогичной стратегии ex vivo explant culture для изучения нейронной проводки в мозге куколки заключается в том, повторяет ли она точный нейрон, нацеленный в состоянии культуры. Основываясь на ранее сообщенном состоянии культуры ex vivo для комплексаглаз-мозг мухи 7, недавно был разработан эксплант, который содержит весь мозг куколки, антенны и неповрежденные соединительные антеннальные нервы, который сохраняет точное нацеливание обонятельной цепи и может подвергаться двухфотонной микроскопии на основе живой визуализации в течение 24 ч на частоте каждые 20 мин8 . Здесь описан подробный протокол эксплантной культуры и визуализации. Эксплантная система обеспечивает мощный метод изучения сборки обонятельной цепи и, возможно, других цепей в центральном мозге.
Protocol
Representative Results
Discussion
Drosophila antennae-brain explant сохраняет нормальное нацеливание обонятельной цепи. Мы заметили, что разработка в 2 раза медленнее ex vivo по сравнению с in vivo. Отмечается, что эксплантная система не удерживает верхнечелюстную пальпу, в которой размещены шесть типов ОРН. Чтобы обеспечить н…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Н. Озеля и Р. Хизингера за их советы по культуре экспланта; М. Вагнеру за техническую помощь в двухфотонной микроскопии; D.J. Luginbuhl для генерации трансгенных мух; Д. Фридманна за предложения по анализу программного обеспечения Фиджи; Y. Ge за помощь в работе на лету; К. Маклафлин и К.К.Л. Вонг за комментарии к рукописи. Л.Л. является исследователем Медицинского института Говарда Хьюза. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения 1K99DC01883001 (для T.L.) и R01-DC005982 (для L.L.).
Materials
| 20-hydroxyecdysone | Sigma | H5142 | |
| Chameleon Ti:Sapphire laser | Coherent | Coherent MRU X1 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10082147 | |
| Human insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Imaging software | Prairie | ||
| Micro Scissors | World Precision Instruments | 501778 | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Oxygen cylinder | Praxair | OX M-E | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Schneider’s Drosophila Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer | Thermo Fisher Scientific | NC0162601 | |
| Two-photon microscopy | Bruker | ||
| water immerse objective (20X) | Zeiss | 421452-9800-000 |
Referências
- Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer. Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727 (2011).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).
- Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genética. 196 (1), 17-29 (2014).
- Bentley, D., Caudy, M. Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells. Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).
- Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline. Journal of Neuroscience. 14 (11), 7024-7039 (1994).
- Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo. Development. 101 (1), 123-133 (1987).
- Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development. Elife. 4, 10721 (2015).
- Li, T., et al. Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging. Cell. 184, 5107-5121 (2021).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Liu, T. L., et al. Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science. 360 (6386), (2018).
- Wang, K., et al. Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes. Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).
- Kohl, J., et al. Ultrafast tissue staining with chemical tags. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).
- Sutcliffe, B., et al. Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed. Genética. 205 (4), 1399-1408 (2017).
- Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments. Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).
