Hjerneorganoid generasjon fra induserte pluripotente stamceller i hjemmelagde minibioreaktorer
Summary
Her beskriver vi en protokoll for å generere hjerneorganoider fra menneskeskapte pluripotente stamceller (iPSCer). For å oppnå hjerneorganoider i store mengder og av høy kvalitet, bruker vi hjemmelagde minibioreaktorer.
Abstract
Den iPSC-avledede hjerneorganoiden er en lovende teknologi for in vitro modellering av patologiene i nervesystemet og legemiddelscreening. Denne teknologien har dukket opp i det siste. Det er fortsatt i sin spede begynnelse og har noen begrensninger uløst ennå. De nåværende protokollene tillater ikke å skaffe organoider til å være konsistente nok til narkotikaoppdagelse og prekliniske studier. Modningen av organoider kan ta opptil et år, og presser forskerne til å starte flere differensieringsprosesser samtidig. Det pålegger laboratoriet ekstra kostnader når det gjelder plass og utstyr. I tillegg har hjerneorganoider ofte en nekrotisk sone i midten, som lider av nærings- og oksygenmangel. Derfor bruker de fleste nåværende protokoller et sirkulerende system for kulturmedium for å forbedre ernæring.
I mellomtiden er det ingen billige dynamiske systemer eller bioreaktorer for organoid dyrking. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å produsere hjerneorganoider i kompakte og rimelige hjemmelagde minibioreaktorer. Denne protokollen gjør det mulig å skaffe organoider av høy kvalitet i store mengder.
Introduction
Humane iPSC-avledede modeller er mye brukt i studier av nevrodevelopmentale og nevrodegenerative lidelser1. I løpet av det siste tiåret komplementerte 3D-hjernevevsmodeller, såkalte hjerneorganoider, i hovedsak tradisjonelle 2D-nevronkulturer2. Organoidene rekapitulerer til en viss grad 3D-arkitekturen til den embryonale hjernen og tillater mer presis modellering. Mange protokoller er publisert for generering av organoider som representerer forskjellige hjerneregioner: hjernebark3,4,5, cerebellum6, midbrain, forebrain, hypothalamus7,8,9og hippocampus10. Det har vært flere eksempler på bruk av organoider for å studere sykdommer i det menneskelige nervesystemet11. Også organoidene ble implementert i narkotikafunn12 og brukt i studier av smittsomme sykdommer, inkludert SARS-Cov-213,14.
Hjerneorganoidene kan nå opptil flere millimeter i diameter. Så kan organoidens indre sone lide av hypoksi eller underernæring og til slutt bli nekrotisk. Derfor inkluderer mange protokoller spesielle bioreaktorer8, shakers eller mikrofluidiske systemer15. Disse enhetene kan kreve store mengder dyre cellekulturmedier. Kostnaden for slikt utstyr er også vanligvis høy. Noen bioreaktorer består av mange mekaniske deler som gjør dem vanskelige å sterilisere for gjenbruk.
De fleste protokoller lider av “batch effekt”16, som genererer betydelig variasjon blant organoider hentet fra de identiske iPSCene. Denne variasjonen hindrer legemiddeltesting eller prekliniske studier som krever ensartethet. Det høye utbyttet av organoider nok til å velge organoider av jevn størrelse kan delvis løse dette problemet.
Tidsfaktoren er også et betydelig problem. Matsui et al. (2018) viste at hjerneorganoider krever minst seks måneder for å nå modenhet17. Trujillo et al. (2019) viste også at elektrofysiologisk aktivitet skjedde i organoider bare etter seks måneder med dyrking18. På grunn av den lange organoidmodningstiden lanserer forskerne ofte ny differensiering før de fullfører den forrige. Flere parallelle differensieringsprosesser krever ekstra utgifter, utstyr og laboratorieplass.
Vi har nylig utviklet en mini bioreaktor som hovedsakelig løser problemene nevnt ovenfor19. Denne hjemmelagde bioreaktoren består av en ultra-lav vedheft eller ubehandlet Petri-tallerken med en plastknott i midten. Denne plastknotten forhindrer trengsel av organoider og deres konglutinasjon i midten av Petri-parabolen, noe som skyldes ristens rotasjon. Dette dokumentet beskriver hvordan denne billige og enkle hjemmelagde minibioreaktoren gjør det mulig å generere hjerneorganoider av høy kvalitet i store mengder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne protokollen har to viktige trinn som tillater generering av høykvalitets organoider av jevn størrelse. For det første vokser organoidene fra sfæroider som er nær identiske i cellenummer og cellemodenhet. For det andre gir de hjemmelagde bioreaktorer hvert organoid et ensartet miljø, hvor organoider ikke samler seg eller holder seg sammen.
Cellekvaliteten og tilstanden til cellemodning er avgjørende for å utføre protokollen. Det er viktig å starte nevronal differensierin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd 075-15-2019-1669 fra Vitenskaps- og høyere utdanningsdepartementet i Russland (RT-PCR-analyse) og ved tilskudd nr. Forfatterne takker også Pavel Belikov for hans hjelp med videoredigering. Figurer i manuskriptet ble laget med BioRender.com.
Materials
| Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | DMEM/F-12 |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies Inc | 34425 | 24-well culture plate with microwells |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Neuronal supplement B |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | 200 mM L-alanyl-L-glutamine |
| Human BDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-285 | |
| Human FGF-2 | Miltenyi Biotec | 130-093-839 | |
| Human GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-290 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | Serum replacement |
| mTESR1 | STEMCELL Technologies Inc | 85850 | Pliripotent stem cell medium |
| N2 Supplement | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | Basal medium for neuronal cell maintenance |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Gibco | 15140130 | |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt-1 | Antimicrobials |
| Purmorphamine | EMD Millipore | 540220 | |
| StemMACS Y27632 | Miltenyi Biotec | 130-106-538 | Y27632 |
| StemMACS Dorsomorphin | Miltenyi Biotec | 130-104-466 | Dorsomorphin |
| StemMACS LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-106-540 | LDN-193189 |
| StemMACS SB431542 | Miltenyi Biotec | 130-106-543 | SB431542 |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 15250061 | |
| Versen solution | Gibco | 15040066 | 0.48 mM EDTA in PBS |
| β-mercaptoethanol | Gibco | 31350010 |
References
- Marchetto, M. C., Winner, B., Gage, F. H. Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Human Molecular Genetics. 19, 71-76 (2010).
- Lee, C. T., Bendriem, R. M., Wu, W. W., Shen, R. F. 3D brain Organoids derived from pluripotent stem cells: promising experimental models for brain development and neurodegenerative disorders. Journal of Biomedical Science. 24 (1), 1-12 (2017).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 110 (50), 20284 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Xiang, Y., et al. Fusion of regionally specified hPSC derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21, 383-398 (2017).
- Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells. Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).
- Qian, X., et al. Brain region specific organoids using mini bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
- Jo, J., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Sakaguchi, H., et al. Generation of functional hippocampal neurons from self-organizing human embryonic stem cell derived dorsomedial telencephalic tissue. Nature Communication. 6 (1), 8896 (2015).
- Di Lullo, E., Kriegstein, A. R. The use of brain organoids to investigate neural development and disease. Nature Reviews Neuroscience. 18 (10), 573-584 (2017).
- Chen, K. G., et al. Pluripotent stem cell platforms for drug discovery. Trends in Molecular Medicine. 24 (9), 805-820 (2018).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Tiwari, S. K., Wang, S., Smith, D., Carlin, A. F., Rana, T. M. Revealing tissue-specific SARS-CoV-2 infection and host responses using human stem cell-derived lung and cerebral organoids. Stem Cell Reports. 16 (3), 437-445 (2021).
- Ao, Z., et al. One-stop microfluidic assembly of human brain organoids to model prenatal cannabis exposure. Analytical Chemistry. 92 (6), 4630-4638 (2020).
- Di Nardo, P., Parker, G. C. Stem cell standardization. Stem Cells Development. 20 (3), 375-377 (2011).
- Jo, J., Xiao, Y., et al. Midbrain like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuro melanin producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
- Matsui, T. K., et al. Six-month cultured cerebral organoids from human ES cells contain matured neural cells. Neuroscience Letters. 670, 75-82 (2018).
- Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569 (2019).
- Eremeev, A. V., et al. Necessity Is the mother of invention” or inexpensive, reliable, and reproducible protocol for generating organoids. Biochemistry (Moscow). 84 (3), 321-328 (2019).
- Qian, X., et al. Generation of human brain region–specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13, 565-580 (2018).
- Matsui, T. K., Tsuru, Y., Hasegawa, K., Kuwako, K. I. Vascularization of human brain organoids. Stem Cells. 39 (8), 1017-1024 (2021).
- Hall, G. N., et al. Patterned, organoid-based cartilaginous implants exhibit zone specific functionality forming osteochondral-like tissues in vivo. Biomaterials. 273, 120820 (2021).
- Zachos, N. C., et al. Human enteroids/colonoids and intestinal organoids functionally recapitulate normal intestinal physiology and pathophysiology. Journal of Biological Chemistry. 291, 3759-3766 (2016).
- Eremeev, A., et al. Cerebral organoids—challenges to establish a brain prototype. Cells. 10 (7), 1790 (2021).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES Cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110, 20284-20289 (2013).
