Summary
Piquer la tête basale de la plante de poivre noir est une méthode brève et rapide pour l’endommager. Ici, nous avons fourni des étapes détaillées avec une vidéo pour infecter les plantes de poivre noir.
Abstract
Piper nigrum L. (poivre noir) est une vigne ligneuse typique qui est une culture d’épices économiquement importante à travers le monde. La production de poivre noir est considérablement affectée par la pourriture des racines causée par Phytophthora capsici, qui a sérieusement influencé le développement de l’industrie en tant que problème de « point d’étranglement ». Cependant, le mécanisme génétique moléculaire de résistance au poivre noir n’est pas clair, ce qui entraîne des progrès lents dans le développement de nouvelles variétés de poivre noir. Une inoculation efficace et un système d’échantillonnage précis de Phytophthora capsici sur les plants de poivre noir sont essentiels pour étudier cette interaction plante-pathogène. L’objectif principal de cette étude est de démontrer une méthodologie détaillée où la tête basale du poivre noir est inoculée avec Phytophthora capsici, tout en fournissant une référence pour l’inoculation des plants de vigne ligneux. La tête basale de la plante de poivre noir a été piquée pour l’endommager, et des granulés de mycélium ont recouvert les trois trous pour retenir l’humidité afin que l’agent pathogène puisse bien infecter la plante. Cette méthode offre un meilleur moyen de résoudre l’instabilité causée par les méthodes d’inoculation traditionnelles, y compris le trempage du sol ou le trempage des racines. Il fournit également un moyen prometteur d’étudier le mode d’action entre les plantes et d’autres agents pathogènes des plantes transmis par le sol dans la sélection de précision agricole.
Introduction
Le poivre noir (Piper nigrum L.) est un grimpeur ligneux et l’une des cultures d’épices les plus importantes. Il est connu sous le nom de « roi des épices »1 et est cultivé dans plus de 40 pays et régions d’Asie, d’Afrique et d’Amérique latine. La pourriture des racines de Phytophthora est la maladie la plus dévastatrice du poivre noir et est causée par l’oomycète Phytophthora capsici. Cet agent pathogène infecte également les cucurbitacées, les aubergines, les piments et les tomates 2,3. Avec le poivre noir, une culture entière peut parfois être décimée par cette maladie. L’expansion des zones de plantation de poivre est limitée en raison de l’indisponibilité des variétés résistantes, ce qui a considérablement entravé le développement de l’industrie chinoise du poivre noir. Une inoculation efficace et un système d’échantillonnage précis de Phytophthora capsici sur les plants de poivre noir sont essentiels pour étudier cette interaction plante-pathogène.
L’identification et le dépistage de la résistance dans les ressources en matériel génétique sont la condition fondamentale pour la recherche sur la pathogénicité de l’agent pathogène et la sélection et l’utilisation de variétés résistantes. Une approche largement utilisée consiste à utiliser une variété de méthodes d’identification basées sur les espèces végétales et les groupes d’agents pathogènes. Les méthodes d’identification actuelles comprennent l’identification de la population, l’identification individuelle, l’identification des organes, l’identification des tissus, l’identification cellulaire, l’identification biochimique et l’identification moléculaire, qui ont été développées au cours des dernières années 4,5. Il y a eu du succès dans ces domaines, mais il y a aussi beaucoup de problèmes. Quelle que soit la méthode choisie, les exigences de base de l’identification de la résistance des plantes sont cohérentes, y compris des objectifs clairs, des résultats fiables et des méthodes simples, rapides et faciles à normaliser. Ce principe doit également être suivi dans l’identification de la résistance au poivre noir.
Dans des conditions de terrain naturel, l’identification de la résistance aux maladies peut être influencée par de nombreux facteurs environnementaux. Par conséquent, il a été proposé d’utiliser en laboratoire des feuilles détachées et des racines irriguées pour identifier la résistance aux maladies. Les jeunes feuilles de plantes saines ont été inoculées in vitro en laboratoire, et la surface des feuilles malades a été mesurée en inoculant l’agent pathogène afin d’identifier la résistance aux maladies des plantes6. Cependant, l’inoculation in vitro des feuilles ne peut être utilisée que pour l’identification générale de la résistance et non pour les études d’interaction moléculaire. Malgré cela, le statut de résistance à la maladie se présente souvent dans l’inoculation racinaire irriguée, ce qui entraîne une incertitude dans l’étude de suivi de la sélection moléculaire pour la résistance aux maladies. Par conséquent, des méthodes de détection intérieure rapides et simples sont essentielles. Cette étude vise à fournir une méthode d’identification de la résistance en laboratoire.
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Protocol
1. Préparation des plants de coupe de poivre noir pour l’infection
- Prenez une coupe à cinq nœuds, d’environ 40 cm de long avec un diamètre de 0,5 cm, à partir d’une branche orthotrope saine et en croissance vigoureuse de poivre noir à l’aide d’un couteau à taille désinfecté ou de sécateurs. Taillez les trois nœuds inférieurs des branches plagiotropes, les deux nœuds supérieurs restants avec environ 10 feuilles intactes.
- Préparer le substrat d’enracinement contenant du sol et du fumier animal (bouse de vache ou bouse de mouton) dans un rapport de 1:1. Autoclaver le substrat d’enracinement à 121 °C pendant 20 min.
- Insérez les boutures dans le substrat d’enracinement à un angle d’environ 50 °, le troisième nœud touchant simplement la surface du substrat et le bourgeon axillaire sur ce nœud au-dessus du substrat.
REMARQUE: Le sac utilisé ici a les dimensions suivantes: hauteur de 40-60 cm, diamètre de 25-30 cm. - Versez 10-20 L d’eau sur les racines de la plante. Placez les boutures dans une serre à 90% d’ombre à une température de 25-30 ° C pour l’enracinement et la croissance.
2. Propagation de Phytophthora capsici (P. capsici)
NOTE: Un stock de culture de Phytophthora capsici est conservé dans le laboratoire de protection des plantes de l’Institut de recherche sur les épices et les boissons, Académie chinoise des sciences agricoles tropicales7.
- Brossez et nettoyez les tubercules de pommes de terre sous l’eau courante du robinet, puis coupez 200 g de pommes de terre en cubes de 1 cm3. Placer certains des cubes dans un bécher contenant 800 mL d’eau double distillée (ddH2O) et faire bouillir pendant 20 min.
- Filtrer le bouillon à travers une double gaze à l’aide d’une filtration par gravité. Préparer la gélose au dextrose (PDA) de pommes de terre en ajoutant 20 g de dextrose et 15 g de gélose au filtrat et en garnissant le volume jusqu’à 1 L de ddH2O. Autoclaver le mélange à 121 °C pendant 20 min8.
- Versez 20 mL du PDA stérilisé sous forme liquide dans une boîte de Petri ronde de 9 cm de diamètre à l’intérieur d’une hotte à flux d’air laminaire. Laissez les plaques PDA avec les couvercles ouverts à l’intérieur de la hotte à flux d’air laminaire pendant la nuit afin d’éviter la condensation.
- Utilisez une boucle d’inoculation pour ramasser le mycélium du stock de Phytophthora capsici à l’intérieur d’un tube à essai. Placez l’inoculum avec le côté mycélien en contact avec le PDA dans une boîte de Pétri.
3. Infection du poivre noir
- Incubation
- Identifiez une zone située à 5 cm au-dessus de la surface du substrat et près des racines sur la tige pour l’inoculation.
- Détacher un disque de mycélium de 0,5 cm de diamètre au bord de croissance de la culture phytophthora capsici sur PDA dans une boîte de Pétri à l’aide d’un foreur de bouchon.
- Endommagez la tige à l’aide d’une aiguille de seringue et faites trois trous dans un motif triangulaire à la zone d’inoculation sélectionnée. Couvrez chaque trou avec un disque mycélien. Placez les trous près les uns des autres pour vous assurer que la zone blessée est entièrement recouverte des disques mycéliens.
- Couvrez les disques mycéliens avec des cotons stérilisés humidifiés afin d’éviter le dessèchement. Attachez le tampon sur la tige avec une bande de polyéthylène pour maintenir la position des disques inoculants.
REMARQUE: À 8 heures après l’inoculation, les trous inoculés sont devenus noirs et la lésion s’est étendue au fil du temps. Les feuilles sont devenues jaunes et sont tombées, et la plante inoculée est morte 7 à 10 jours après l’inoculation. Aucune lésion ne s’est développée dans les usines de contrôle. La plupart des gènes exprimés différemment après l’inoculation avec Phytophthora capsici par rapport au groupe témoin. L’analyse histopathologique des tissus infectés a démontré que Phytophthora capsici colonisait le xylème.
- Échantillonner les matières végétales d’intérêt et les stocker à -80 °C dans de l’azote liquide pour une utilisation dans des études ultérieures.
REMARQUE: De l’azote liquide, des sacs en plastique, des stylos marqueurs, des cisailles à branches et d’autres matériaux ont été préparés avant les expériences. - Une fois que les matières végétales spécifiques ont été échantillonnées pour utilisation, autoclavez toutes les matières végétales restantes, les restes de culture et de milieu de culture de Phytophthora capsici , ainsi que tous les instruments et le matériel de laboratoire utilisés dans ce travail d’inoculation.
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Representative Results
La figure 1 montre les symptômes des feuilles de poivre noir après l’inoculation de P. capsici . La figure 2 montre les symptômes des tiges de poivre noir après l’inoculation de P. capsici . L’agent pathogène a infecté le poivre noir à la tige basale; les symptômes, y compris le jaunissement des feuilles, l’apparition du flétrissement, le brunissement du xylème et le noircissement progressif des vaisseaux. La figure 3 montre la plupart des gènes exprimés différemment après l’inoculation avec Phytophthora capsici par rapport au groupe témoin. La figure 4 a démontré que Phytophthora capsici a colonisé le xylème par l’analyse histopathologique des tissus infectés.
Figure 1 : Les symptômes des feuilles de poivre noir suite à l’inoculation de P. capsici 7. CK: groupe témoin; Inoculé: après inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Symptôme des tiges de poivre noir suivant l’inoculation de P. capsici 7. Inoculé: après inoculation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Profils d’expression détaillés des gènes dans les racines du poivre noir. Les barres d’erreur dans les figures indiquent l’erreur-type des niveaux d’expression de trois réplications biologiques. CK-8, CK-12, CK-24, CK-48, 8, 12, 24 et 48 sur l’axe des x se réfèrent respectivement à 8, 12, 24 et 48 h sur la commande et à 8, 12, 24 et 48 h, après inoculation avec P. capsici. L’axe des y représente le niveau d’expression relatif par rapport à l’ubiquitine. Chaque colonne représente la valeur moyenne plus ET (écart-type) de trois réplicats biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Analyse histopathologique des tissus infectés. Comparaison entre la coloration O bleu toluidine seule (colonne de gauche) et la coloration bleue de coton et safranin O (colonne de droite) (20X). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans cette étude, la tête basale a été piquée pour endommager et fournir un système d’inoculation efficace dans la plante de poivre noir. Des pastilles mycéliennes ont ensuite recouvert les trois trous pour retenir l’humidité et permettre à l’agent pathogène de bien infecter la plante. Après l’inoculation, les feuilles sont devenues jaunes et sont tombées et les plantes inoculées sont mortes. Aucune lésion ne s’est développée dans les usines de contrôle. La plupart des gènes exprimés différemment après l’inoculation avec Phytophthora capsici par rapport au groupe témoin. Les maladies fongiques sont responsables de troubles structurels et physiologiques dans un nombre important de cultures, entraînant une baisse de productivité et des pertes économiques pour leurs producteurs. Les études structurales utilisant des techniques histologiques sur le mode de pénétration et de colonisation des tissus végétaux par les champignons fournissent une indication détaillée des interactions entre l’agent pathogène et le tissu végétal. Ces études ont révélé des aspects importants pour aider à comprendre le monocycle des maladies. L’analyse histopathologique des tissus infectés a montré que Phytophthora capsici colonisait le xylème. Cette méthode fournit un meilleur moyen de résoudre l’instabilité causée par les méthodes d’inoculation traditionnelles, y compris le trempage du sol ou le trempage des racines. Une inoculation efficace et un système d’échantillonnage précis de Phytophthora capsici sur les plants de poivre noir sont essentiels pour étudier cette interaction plante-pathogène. Il fournit également un moyen prometteur d’étudier le mode d’action entre les plantes et d’autres agents pathogènes des plantes transmis par le sol dans la sélection de précision agricole.
Dans le même temps, ce protocole représente un moyen plus efficace de fournir une référence pour l’incubation de la vigne ligneuse. Dans des études antérieures, les agents pathogènes ont été inoculés par trempage des racines avec des suspensions de spores cultivées dans le milieu V89. Il faut 7 jours pour que la suspension de spores soit prête, alors que l’utilisation de PDA pour cultiver Phytophthora capsici ne prend que 5 jours. La plaque PDA a été scellée à l’aide d’un ruban chirurgical perméable afin d’éviter la contamination par d’autres bactéries et champignons. Les cultures ont été maintenues à température ambiante. La méthode utilisée dans cette étude permet de gagner plus de temps et d’être réalisée plus rapidement. Le poivre noir est une vigne ligneuse avec de nombreux sucres et phénols10, et les zoospores produites par Phytophthora capsici se produisent généralement dans les sols, ce qui rend difficile l’infection des vignes de poivre noir et provoque une instabilité de l’infection dans la racine11. Ce protocole fournit de meilleurs résultats, permettant une forte interaction entre les plants de vigne et les agents pathogènes transmis par le sol. La détection du processus dynamique entre les plantes et les agents pathogènes est visible et pratique.
La méthode d’irrigation des racines est rapide et permet de gagner du temps, mais un problème reste non résolu pour le poivre noir. Phytophthora capsici est un agent pathogène transmis par le sol qui infecte généralement les racines des plantes par l’intermédiaire des sporanges et des zoospores12. Dans la nature, les sporanges sont capables de se propager par la pluie et l’irrigation. Une fois que les zoospores sont attachées à la surface de la plante, les tubes germinaux peuvent rapidement se développer et pénétrer dans le tissu végétal, ce qui entraîne une infection13,14. Cela peut entraîner une incertitude quant au fait que le choix des hyphes comme source d’infection sera similaire à la suspension de spores. La méthode utilisée dans cette étude commence par piquer la tête basale de la plante de poivre noir pour l’endommager. La zone endommagée est ensuite recouverte de Phytophthora capsici et l’humidité est retenue, ce qui garantit que l’agent pathogène peut bien infecter la plante. Cette méthode est meilleure pour résoudre l’instabilité causée par les méthodes d’inoculation traditionnelles, y compris le trempage du sol ou le trempage des racines. C’est également une méthode prometteuse pour étudier le mode d’action entre les plantes et d’autres agents pathogènes des plantes transmis par le sol dans la sélection de précision agricole.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu financièrement par le National Key R&D Program of China (2020YFD1001200), le China Agriculture Research System (CARS-11), le fonds de recherche spécifique de The Innovation Platform for Academicians of Hainan Province (YSPTZX202154), la Natural Science Foundation of Hainan Province of China (321RC652) et la Natural Science Foundation of China (No. 31601626).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar powder | Solarbio | A8190 | |
| Clean bench | Haier | ||
| Dextrose | Xilong Scientific | 15700501 | |
| High temperature sterilizing oven | Zaelway | ||
| Petri dish plates | Biosharp | BS-90-D |
References
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