Denne protokollen beskriver en forbedret metode for å syntetisere høye utbytter av rekombinante proteiner fra et Streptomyces venezuelae cellefri transkripsjon-oversettelsessystem (TX-TL).
Streptomyces spp. er en viktig kilde til kliniske antibiotika og industrielle kjemikalier. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 er en raskt voksende stamme og en naturlig produsent av kloramfenikol, jadomycin og pikromycin, noe som gjør det til en attraktiv kandidat som neste generasjons syntetisk biologi chassis. Derfor er genetiske verktøy som akselererer utviklingen av S. venezuelae ATCC 10712, samt andre Streptomyces spp. modeller, svært ønskelige for naturlig produktteknikk og oppdagelse. For dette formål er et dedikert S. venezuelae ATCC 10712 cellefritt system gitt i denne protokollen for å muliggjøre høy avkastning heterologt uttrykk for høye G + C (%) gener. Denne protokollen er egnet for småskala (10-100 μL) batchreaksjoner i enten 96-brønns eller 384-brønns plateformat, mens reaksjoner er potensielt skalerbare. Det cellefrie systemet er robust og kan oppnå høye utbytter (~ 5-10 μ M) for en rekke rekombinante proteiner i et minimalt oppsett. Dette arbeidet inneholder også et bredt plasmidverktøysett for sanntidsmåling av mRNA og proteinsyntese, samt fluorescensfarging av taggede proteiner i gel. Denne protokollen kan også integreres med genuttrykkskarakteriseringsarbeidsflyter med høy gjennomstrømning eller studiet av enzymveier fra høye G+C-gener (%) som finnes i Actinomycetes-genomer.
Cellefrie transkripsjonsoversettelsessystemer (TX-TL) gir en ideell prototypingsplattform for syntetisk biologi for å implementere raske design-bygg-test-læringssykluser, det konseptuelle ingeniørrammeverket for syntetisk biologi1. I tillegg er det økende interesse for TX-TL-systemer for høyverdig rekombinant proteinproduksjon i et miljø med åpen reaksjon2, for eksempel for å inkorporere ikke-standard aminosyrer i antistoff-medikamentkonjugater3. Spesielt krever TX-TL et celleekstrakt, plasmid eller lineært DNA, og en energiløsning for å katalysere proteinsyntese i batch eller semikontinentale reaksjoner. Mens Escherichia coli TX-TL er det dominerende cellefrie systemet, har en rekke nye TX-TL-systemer uten modell tiltrukket seg oppmerksomhet for forskjellige applikasjoner4,5,6,7,8. Viktige fordeler med TX-TL inkluderer fleksibel skalerbarhet (nanoliter til liter skala)9,10, sterk reproduserbarhet og automatiserte arbeidsflyter8,11,12. Spesielt tillater automatisering av TX-TL akselerert karakterisering av genetiske deler og regulatoriske elementer8,12,13.
Når det gjelder reaksjonsoppsett, krever TX-TL både primære og sekundære energikilder, samt aminosyrer, kofaktorer, tilsetningsstoffer og en mal-DNA-sekvens. Nukleotid tripfosfater (NTPer) gir den primære energikilden til å kjøre første mRNA (ATP, GTP, CTP og UTP) og proteinsyntese (bare ATP og GTP). For å øke TX-TL-utbyttet regenereres NTPer gjennom katabolismen til en sekundær energikilde, som maltose14, maltodextrin15, glukose14, 3-fosfoglyserat (3-PGA) 16, fosfoenolpyruvate17 og L-glutamat18. Denne iboende metabolske aktiviteten er overraskende allsidig, men likevel dårlig studert, spesielt i nye TX-TL-systemer. Hver energikilde har distinkte egenskaper og fordeler når det gjelder ATP-utbytte, kjemisk stabilitet og kostnad, noe som er et viktig hensyn for oppskalerte TX-TL-reaksjoner. Så langt har dagens protokoller for E. coli TX-TL nådd opptil 4,0 mg/ml (~157 μM) for modellen grønt fluorescerende protein (GFP), ved hjelp av en blanding på 3-PGA (30 mM), maltodextrin (60 mM) og D-ribose (30 mM) som sekundær energikilde19.
Nylig har det vært en økende interesse for å studere sekundære metabolitt biosyntetiske veier i TX-TL-systemer20,21,22. Spesielt er Actinobacteria en viktig kilde til sekundære metabolitter, inkludert antibiotika og landbrukskjemikalier23,24. Deres genomer er beriket med såkalte biosyntetiske genklynger (BGCs), som koder enzymatiske veier for sekundær metabolittbiosyntese. For studiet av Actinobacteria genetiske deler og biosyntetiske veier, har en rekke Streptomyces-baserte TX-TL-systemer nylig blitt utviklet5,6,25,26. Disse spesialiserte Streptomyces TX-TL-systemene er potensielt gunstige av følgende grunner: [1] levering av et innfødt proteinfoldingsmiljø for enzymer fra Streptomyces spp.26; [2] tilgang til et optimalt tRNA-basseng for høyt G+C (%)-genuttrykk; [3] aktiv primærmetabolisme, som potensielt kan kapres for tilførsel av biosyntetiske forløpere; og [4] levering av enzymer, forløpere eller kofaktorer fra sekundær metabolisme tilstede i det opprinnelige celleekstraktet. Derfor har det nylig blitt etablert et høyverdig S.venezuelae TX-TL-verktøysett for å utnytte disse unike egenskapene5.
Streptomyces venezuelae er en ny vert for syntetisk biologi med en rik historie innen industriell bioteknologi5,27,28,29 og som et modellsystem for å studere celledeling og genetisk regulering i Actinobacteria30,31,32. Hovedtypestammen, S. venezuelae ATCC 10712, har et relativt stort genom på 8,22 Mb med 72,5% G+C-innhold (%) (Tiltredelsesnummer: CP029197), som koder 7377 kodingssekvenser, 21 rRNAer, 67 tRNAer og 30 biosyntetiske genklynger27. I syntetisk biologi er S. venezuelae ATCC 10712 et attraktivt chassis for det heterografiske uttrykket av biosyntetiske veier. I motsetning til de fleste andre Streptomyces flekker, gir det flere viktige fordeler, inkludert en rask doblingstid (~ 40 min), et omfattende utvalg av genetiske og eksperimentelle verktøy5,28, mangel på mycelial klumping og sporulering i flytende medier28,33. Flere studier har også vist bruk av S. venezuelae for heterolog produksjon av et mangfoldig utvalg av sekundære metabolitter, inkludert polyketider, ribosomale og ikke-ibosomale peptider34,35,36,37,38. Disse kombinerte funksjonene gjør denne stammen til en attraktiv mikrobiell vert for syntetisk biologi og metabolske ingeniørapplikasjoner. Selv om S. venezuelae ikke er den dominerende Streptomyces-modellen for heterologt genuttrykk, med videre utvikling, er den klar for bredere bruk innen naturlig produktoppdagelse.
Dette manuskriptet presenterer en detaljert protokoll (figur 1) for et høy avkastning S. venezuelae TX-TL-system, som er oppdatert fra den opprinnelige tidligere publiserte protokollen26. I dette arbeidet er energiløsningen og reaksjonsforholdene optimalisert for å øke proteinutbyttet opp til 260 μg / ml for mScarlet-I reporterproteinet i en 4 h, 10 μL batchreaksjon, ved hjelp av en standard plasmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Denne plasmiden er spesielt designet for å muliggjøre ulike metoder for å oppdage proteinuttrykk. Protokollen er også strømlinjeformet, mens energisystemet er optimalisert for å redusere kompleksiteten og kostnadene ved å sette opp cellefrie reaksjoner uten at det går ut over utbyttet. Sammen med det optimaliserte TX-TL-systemet er det utviklet et bibliotek med genetiske deler for finjustering av genuttrykk og som fluorescerende verktøy for overvåking av TX-TL i sanntid, og skaper dermed en allsidig plattform for prototyping av genuttrykk og biosyntetiske veier av naturlig produkt fra Streptomyces spp. og relaterte Actinobacteria.
I dette arbeidet kan den anbefalte standard plasmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) brukes til å etablere arbeidsflyten S. venezuelae TX-TL i et nytt laboratorium og er tilgjengelig på AddGene (se Supplerende tabell S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I gir brukeren fleksibilitet til å studere andre åpne leserammer (ORFer). mScarlet-I ORF er codon-optimalisert for S. Venezuelae genuttrykk. SP44-promotoren er en sterk konstituerende promotør som er svært aktiv i både E. coli og Streptomyces spp.39. Plasmiden har to unike begrensningsenzymsteder (NdeI, BamHI) for å tillate sub-kloning av nye ORFer i rammen med en felles C-terminal FLAG-tag og fluorescein arsenisk hårnål (FlAsH) bindemiddel tag system. Alternativt kan begge taggene fjernes med inkludering av en stoppkodon etter underkloning av et nytt gen. Med denne basevektoren har høyavkastningsuttrykket til en rekke proteiner blitt demonstrert, nemlig proteiner fra oxytetracycline biosyntesebanen og en ukarakterisert ikke-ibosomal peptidsyntetase (NRPS) fra Streptomyces rimosus (figur 2). Når det gjelder mRNA-deteksjon, inneholder pTU1-A-SP44-mScarlet-I standard plasmid en dBroccoli aptamer (i 3′-untranslated regionen) for deteksjon med 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) sonde. For økt fleksibilitet er et verktøysett med EcoFlex40-kompatible MoClo-deler også gjort tilgjengelig på AddGene, inkludert en EcoFlex-kompatibel Streptomyces shuttle vektor (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) og en rekke pTU1-A-SP44 variant plasmider som uttrykker superfolder grønt fluorescensprotein (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I og β-glucuronidase (GUS). Spesielt er pSF1C-A plasmid avledet fra pAV-gapdh28 og er herdet av BsaI / BsmBI-nettsteder for MoClo-montering. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP tilsvarer pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP fra EcoFlex40, men inneholder tilleggsfunksjonalitet for konjugering og kromosommal integrasjon i Streptomyces spp. ved hjelp av phiC31 integrase-systemet28.
Den første fasen av protokollen innebærer veksten av S. venezuelae ATCC 10712 eller en nært beslektet stamme, cellehøsting i midteksponentiell fase, cellevasktrinn og likevekt i S30A- og S30B-buffere. Dette stadiet krever tre dager, og tiden for cellevekst kan brukes til å forberede de resterende komponentene som beskrevet nedenfor. De høstede cellene blir deretter lysnet av sonikering, avklart og gjennomgår en avrenningsreaksjon. På dette siste forberedelsesstadiet kan celleekstraktene fremstilles for langtidslagring ved -80 °C for å minimere tap av aktivitet. For montering av TX-TL-reaksjoner ved hjelp av denne protokollen presenteres en Streptomyces Master Mix (SMM), med mulighet for et minimalt energiløsningsformat (MES) som gir sammenlignbare utbytter. Videre anbefales det å strekke en frisk kultur av S. venezuelae ATCC 10712 fra en -80 ° C glyserol lager på en GYM agar plate og inkubere ved 28 ° C i minst 48-72 timer til enkle kolonier er synlige. Bare friske kulturer bør brukes til følgende trinn.
I dette manuskriptet har en høyverdig TX-TL-protokoll blitt beskrevet med detaljerte trinn som er enkle å gjennomføre for både erfarne og nye brukere av TX-TL-systemer. Flere funksjoner fra eksisterende Streptomyces45– og E. coli TX-TL41-protokoller er fjernet for å etablere en minimal, men likevel høy avkastningsprotokoll for S. venezuelae TX-TL5,26. Arbeidsflyten som anbef…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å anerkjenne følgende forskningsstøtte: EPSRC [EP/K038648/1] for SJM som en PDRA med PSF; Wellcome Trust sponset ISSF-stipend for SJM med PSF ved Imperial College London; Royal Society forskningsstipend [RGS\R1\191186]; Wellcome Trust SEED-prisen [217528/Z/19/Z] for SJM ved University of Kent; og Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. stipend for KC ved University of Kent.
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |