Bu protokol, Streptomyces venezuelae hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sisteminden yüksek rekombinant protein verimini sentezlemek için geliştirilmiş bir yöntemi detaylandırmamaktadır.
Streptomices spp. klinik antibiyotiklerin ve endüstriyel kimyasalların önemli bir kaynağıdır. Streptomices venezuelae ATCC 10712, hızlı büyüyen bir suş ve doğal bir kloramfenikol, jadomycin ve pikromisin üreticisidir, bu da onu yeni nesil sentetik biyoloji şasisi olarak çekici bir aday haline getirir. Bu nedenle, S. venezuelae ATCC 10712’nin ve diğer Streptomyces spp. modellerinin gelişimini hızlandıran genetik araçlar, doğal ürün mühendisliği ve keşfi için son derece arzu edilir. Bu amaçla, yüksek G+C (%) genlerinin yüksek verimli heterolog ekspresyonlarını sağlamak için bu protokolde özel bir S. venezuelae ATCC 10712 hücresiz sistem sağlanmıştır. Bu protokol, 96 kuyu veya 384 kuyu plaka biçimindeki küçük ölçekli (10-100 μL) parti reaksiyonları için uygundur, reaksiyonlar ise potansiyel olarak ölçeklenebilir. Hücresiz sistem sağlamdır ve minimum kurulumda bir dizi rekombinant protein için yüksek verim (~5-10 μ M) elde edebilir. Bu çalışma ayrıca mRNA ve protein sentezinin gerçek zamanlı ölçümü ve etiketli proteinlerin jel içi floresan boyanma için geniş bir plazmid araç seti içerir. Bu protokol ayrıca yüksek verimli gen ekspresyon karakterizasyon iş akışları veya Actinomycetes genomlarında bulunan yüksek G+C (%) genlerinden enzim yollarının incelenmesi ile entegre edilebilir.
Hücresiz transkripsiyon-çeviri (TX-TL) sistemleri, sentetik biyoloji için kavramsal mühendislik çerçevesi olan hızlı tasarım-yap-test-öğrenme döngülerini uygulamak için sentetik biyoloji için ideal bir prototipleme platformu sağlar1. Buna ek olarak, açık reaksiyon ortamında yüksek değerli rekombinant protein üretimi için TX-TL sistemlerine olan ilgi artmaktadır2, örneğin, antikor-ilaç konjugelerine standart dışı amino asitleri dahil etmek3. Özellikle, TX-TL bir hücre özü, plazmid veya doğrusal DNA ve protein sentezini toplu veya yarı iletken reaksiyonlarda katalize etmek için bir enerji çözeltisi gerektirir. Escherichia coli TX-TL baskın hücresiz sistem olmakla birlikte, farklı uygulamalar için bir dizi gelişmekte olan modelsiz TX-TL sistemi dikkat çekmiştir4,5,6,7,8. TX-TL’nin temel avantajları arasında esnek ölçeklenebilirlik (nanoliterden litreye kadar ölçek)9,10, güçlü tekrarlanabilirlik ve otomatik iş akışları8,11,12 sayılabilir. Özellikle, TX-TL’nin otomasyonu genetik parçaların ve düzenleyici unsurların hızlandırılmış karakterizasyonuna izin vermektedir8,12,13.
Reaksiyon kurulumu açısından, TX-TL hem birincil hem de ikincil enerji kaynaklarının yanı sıra amino asitler, kofaktörler, katkı maddeleri ve şablon DNA dizisi gerektirir. Nükleotid trifosfatlar (NTP’ler), ilk mRNA (ATP, GTP, CTP ve UTP) ve protein sentezini (yalnızca ATP ve GTP) yönlendirmek için birincil enerji kaynağını sağlar. TX-TL verimini artırmak için NTP’ler maltose14, maltodekstrin15, glikoz14, 3 fosfolycerat (3-PGA)16, fosforilolpyruvate17 ve L-glutamat18 gibi ikincil bir enerji kaynağının katabolizması yoluyla yenilenir. Bu doğal metabolik aktivite şaşırtıcı derecede çok yönlüdür, ancak özellikle gelişmekte olan TX-TL sistemlerinde kötü çalışılmıştır. Her enerji kaynağının ATP verimi, kimyasal stabilite ve maliyet açısından farklı özellikleri ve avantajları vardır, bu da ölçeklenmiş TX-TL reaksiyonları için önemli bir husustur. Şimdiye kadar, E. coli TX-TL için mevcut protokoller, ikincil enerji kaynağı olarak 3-PGA (30 mM), maltodekstrin (60 mM) ve D-riboz (30 mM) karışımı kullanılarak, model yeşil floresan protein (GFP) için 4,0 mg/mL’ye (~157 μM) kadar ulaşmıştır19.
Son zamanlarda TX-TL sistemlerinde sekonder metabolit biyosintetik yolların incelenmesine olan ilgi artmaktadır20,21,22. Özellikle, Actinobacteria antibiyotikler ve tarımsal kimyasallar da dahil olmak üzere ikincil metabolitlerin önemli bir kaynağıdır23,24. Genomları, ikincil metabolit biyosentezi için enzimatik yolları kodlayan biyosentetik gen kümeleri (BGC’ ler) ile zenginleştirilmiştir. Actinobacteria genetik parçaları ve biyosintetik yolların incelenmesi için yakın zamanda streptomices bazlı bir dizi TX-TL sistemi geliştirilmiştir5,6,25,26. Bu özel Streptomyces TX-TL sistemleri aşağıdaki nedenlerden dolayı potansiyel olarak faydalıdır: [1] Streptomyces spp.26 enzimleri için yerel bir protein katlama ortamının sağlanması; [2] yüksek G+C (%) gen ekspresyörü için en uygun tRNA havuzuna erişim; [3] biyosintetik öncüllerin temini için potansiyel olarak kaçırılabilen aktif birincil metabolizma; ve [4] yerel hücre özünde bulunan ikincil metabolizmadan enzimlerin, öncüllerin veya kofaktörlerin sağlanması. Bu nedenle, bu benzersiz yetenekleri kullanmak için son zamanlarda yüksek verimli bir S.venezuelae TX-TL araç seti kuruldu5.
Streptomyces venezuelae, endüstriyel biyoteknolojide zengin bir geçmişe sahip sentetik biyoloji için 5,27,28,29 ve Actinobacteria30,31,32’de hücre bölünmesi ve genetik düzenlemeyi incelemek için bir model sistemi olarak ortaya çıkan bir konaktır. Ana tip suş olan S. venezuelae ATCC 10712, 7377 kodlama dizisi, 21 rRNA, 67 tRNA ve 30 biyosinatik gen kümesini kodlayan % 72,5 G+C içeriği (%) (Katılım numarası: CP029197) ile 8,22 Mb’lık nispeten büyük bir genoma sahiptir. Sentetik biyolojide, S. venezuelae ATCC 10712 biyosentetik yolların heterolog ifadesi için çekici bir şasidir. Diğer Streptomices lekelerinin aksine, hızlı bir iki katına (~40 dk), geniş bir genetik ve deneysel araç yelpazesi5,28, misel topaklanma eksikliği ve sıvı ortamda sporülasyon dahil olmak üzere çeşitli önemli avantajlar sağlar28,33. Çeşitli çalışmalar ayrıca poliketitler, ribozomal ve nonribosomal peptitler34,35,36,37,38 dahil olmak üzere çeşitli ikincil metabolitlerin heterolog üretimi için S. venezuelae’nin kullanıldığını göstermiştir. Bu kombine özellikler, bu suşunu sentetik biyoloji ve metabolik mühendislik uygulamaları için çekici bir mikrobiyal konak haline getirir. S. venezuelae heterolog gen ekspresyolu için baskın Streptomices modeli olmasa da, daha fazla gelişme ile, doğal ürün keşfi içinde daha geniş kullanım için hazırlanır.
Bu makale, daha önce yayınlanan ilk protokol26’dan güncellenen yüksek verimli bir S. venezuelae TX-TL sistemi için ayrıntılı bir protokol (Şekil 1) s sunulmuştur. Bu çalışmada, enerji çözeltisi ve reaksiyon koşulları, standart bir plazmid, pTU1-A-SP44-mScarlet-I kullanılarak, 4 saat, 10 μL parti reaksiyonunda mScarlet-I muhabir proteini için protein verimini 260 μg / mL’ye kadar artıracak şekilde optimize edilmiştir. Bu plazmid, protein ekspresyonunun çeşitli yöntemlerini tespit etmek için özel olarak tasarlanmıştır. Protokol ayrıca düzene sokılırken, enerji sistemi verimden ödün vermeden hücresiz reaksiyonların kurulmasının karmaşıklığını ve maliyetini azaltmak için optimize edilmiştir. Optimize edilmiş TX-TL sistemi ile birlikte, gen ekspresyonunun ince ayar için ve TX-TL’yi gerçek zamanlı olarak izlemek için floresan araçlar olarak bir genetik parça kütüphanesi geliştirilmiştir, böylece Streptomyces spp. ve ilgili Actinobacteria’dan gen ekspresyonunu ve doğal ürün biyosentetik yollarını prototiplendirmek için çok yönlü bir platform oluşturulmuştur.
Bu çalışmada, önerilen standart plazmid (pTU1-A-SP44-mScarlet-I), yeni bir laboratuvarda S. venezuelae TX-TL iş akışını kurmak için kullanılabilir ve AddGene’de mevcuttur (bkz. Ek Tablo S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I, kullanıcıya diğer açık okuma çerçevelerini (ORF’ ler) inceleme esnekliği sağlar. mScarlet-I ORF, S. venezuelae gen ekspresyon için kodon için optimize edilmiştir. SP44 promotörü, hem E. coli hem de Streptomyces spp.39’da oldukça aktif olan güçlü bir kurucu organizatördür. Plazmid, yeni ORF’lerin ortak bir C terminali FLAG-tag ve floresan arsenik saç tokası (FlAsH) bağlayıcı etiket sistemi ile çerçevede alt klonlamasına izin vermek için iki benzersiz kısıtlama enzim bölgesine (NdeI, BamHI) sahiptir. Alternatif olarak, her iki etiket de yeni bir geni alt klonladıktan sonra bir stop codon dahil edilerek kaldırılabilir. Bu baz vektör ile, bir dizi proteinin yüksek verimli ekspresyumu gösterilmiştir, yani oksitetrasiklin biyosentez yolundan proteinler ve Streptomyces rimosus’tan karakteristik olmayan bir nonribosomal peptit sentezi (NRPS). mRNA algılama açısından, pTU1-A-SP44-mScarlet-I standart plazmid, 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) probu ile tespit için bir dBroccoli aptamer (3′-çevrilmemiş bölgede) içerir. Daha fazla esneklik için, EcoFlex40 uyumlu MoClo parçalarından oluşan bir araç seti de AddGene’de kullanıma sunulmuştur, EcoFlex uyumlu Streptomyces mekik vektörü (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ve süper klasör yeşil floresan proteinini (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I ve β-glucuronidaz (GUS). Özellikle, pSF1C-A plazmid pAV-gapdh28’den türetilmiştir ve MoClo montajı için BsaI / BsmBI sitelerinden iyileştirilmiştir. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP, EcoFlex40’tan pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP’ye eşdeğerdir, ancak Streptomyces spp’de konjugasyon ve kromozomal entegrasyon için ek işlevsellik içerir. phiC31 integrase sistemini kullanarak28.
Protokolün ilk aşaması , S. venezuelae ATCC 10712’nin büyümesini veya yakından ilişkili bir suş, orta üstel fazda hücre hasadı, hücre yıkama adımları ve S30A ve S30B tamponlarında dengeyi içerir. Bu aşama üç gün gerektirir ve hücre büyümesi için zaman, aşağıda açıklandığı gibi kalan bileşenleri hazırlamak için kullanılabilir. Hasat edilen hücreler daha sonra sonication tarafından lislenir, netleştirilir ve bir çalıştırma reaksiyonuna tabi edilir. Hazırlığın bu son aşamasında, hücre özleri aktivite kaybını en aza indirmek için -80 ° C’de uzun süreli depolama için hazırlanabilir. Bu protokolü kullanarak TX-TL reaksiyonlarının montajı için, karşılaştırılabilir verim veren Minimal Enerji Çözümü formatı (MES) seçeneğine sahip bir Streptomices Master Mix (SMM) sunulmaktadır. Ayrıca, bir -80 °C gliserol stoğundan bir GYM agar plakasına S. venezuelae ATCC 10712’nin taze bir kültürünün çizİlmesi ve tek koloniler görünene kadar en az 48-72 saat boyunca 28 °C’de kuluçkaya yatmanız önerilir. Aşağıdaki adımlar için yalnızca taze kültürler kullanılmalıdır.
Bu yazıda, TX-TL sistemlerinin hem deneyimli hem de yeni kullanıcıları için yürütülmesi kolay ayrıntılı adımlarla yüksek verimli bir S. venezuelae TX-TL protokolü açıklanmıştır. Mevcut Streptomyces45 ve E. coli TX-TL41 protokollerinden çeşitli özellikler, S. venezuelae TX-TL5,26 için minimal, ancak yüksek verimli bir protokol oluşturmak için kaldırılmıştır…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar aşağıdaki araştırma desteğini kabul etmek isterler: PSF’li bir PDRA olarak SJM için EPSRC [EP/K038648/1] ; Wellcome Trust, Imperial College London’da PSF ile SJM için ISSF bursu sponsoru oldu; Royal Society araştırma hibesi [RGS\R1\191186]; Kent Üniversitesi’nde SJM için Wellcome Trust SEED ödülü [217528/Z/19/Z]; ve Kent Üniversitesi’nde KC için Global Challenges Araştırma Fonu (GCRF) doktora bursu.
2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
Equipment | |||
Platereader | BMG | Omega |