مجموعة أدوات النسخ والترجمة العقدية عالية الإنتاجية للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات المنتجات الطبيعية
Summary
يفصل هذا البروتوكول طريقة محسنة لتوليف غلة عالية من البروتينات المؤتلفة من نظام ترجمة النسخ الخالي من الخلايا العقدية الفنزويلية (TX-TL).
Abstract
العقديات spp. هي مصدر رئيسي للمضادات الحيوية السريرية والمواد الكيميائية الصناعية. العقديات الفنزويلية ATCC 10712 هي سلالة سريعة النمو ومنتج طبيعي للكلورامفينيكول والجادوميسين والبيكروميسين ، مما يجعلها مرشحا جذابا كهيكل بيولوجي تركيبي من الجيل التالي. لذلك ، فإن الأدوات الوراثية التي تسرع تطوير S. venezuelae ATCC 10712 ، بالإضافة إلى نماذج Streptomyces spp. الأخرى ، مرغوبة للغاية لهندسة المنتجات الطبيعية واكتشافها. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم توفير نظام S . venezuelae ATCC 10712 الخالي من الخلايا في هذا البروتوكول لتمكين التعبير غير المتجانس عالي الإنتاجية لجينات G + C العالية (٪). هذا البروتوكول مناسب لتفاعلات الدفعات الصغيرة (10-100 ميكرولتر) إما في شكل لوحة 96 بئر أو 384 بئر ، في حين أن التفاعلات قابلة للتطوير. النظام الخالي من الخلايا قوي ويمكنه تحقيق غلة عالية (~ 5-10 μ M) لمجموعة من البروتينات المؤتلفة في الحد الأدنى من الإعداد. يتضمن هذا العمل أيضا مجموعة أدوات بلازميد واسعة للقياس في الوقت الفعلي للحمض النووي الريبوزي المرسال وتخليق البروتين ، بالإضافة إلى تلطيخ التألق في الجل للبروتينات الموسومة. يمكن أيضا دمج هذا البروتوكول مع سير عمل توصيف التعبير الجيني عالي الإنتاجية أو دراسة مسارات الإنزيم من جينات G + C العالية (٪) الموجودة في جينومات الأكتينوميسيت.
Introduction
توفر أنظمة النسخ والترجمة الخالية من الخلايا (TX-TL) منصة نموذجية مثالية للبيولوجيا التركيبية لتنفيذ دورات التصميم والبناء والاختبار والتعلم السريعة، وهي الإطار الهندسي المفاهيمي للبيولوجيا التركيبية1. وبالإضافة إلى ذلك، هناك اهتمام متزايد بأنظمة TX-TL لإنتاج البروتين المؤتلف عالي القيمة في بيئة التفاعل المفتوح2، على سبيل المثال، لدمج الأحماض الأمينية غير القياسية في مترافقات الأجسام المضادة والأدوية3. على وجه التحديد ، يتطلب TX-TL مستخلصا خلويا أو بلازميد أو حمض نووي خطي ، ومحلول طاقة لتحفيز تخليق البروتين على دفعة واحدة أو تفاعلات شبه مستمرة. في حين أن الإشريكية القولونية TX-TL هي النظام المهيمن الخالي من الخلايا ، فقد جذب عدد من أنظمة TX-TL الناشئة غير النموذجية الانتباه إلى تطبيقات مختلفة4,5,6,7,8. تشمل المزايا الرئيسية ل TX-TL قابلية التوسع المرنة (مقياس نانولتر إلى لتر) 9,10 ، وقابلية إعادة إنتاج قوية ، وسير عمل تلقائي8,11,12. وعلى وجه الخصوص، تسمح أتمتة TX-TL بالتوصيف المتسارع للأجزاء الوراثية والعناصر التنظيمية8،12،13.
من حيث إعداد التفاعل ، يتطلب TX-TL مصادر طاقة أولية وثانوية ، بالإضافة إلى الأحماض الأمينية والعوامل المساعدة والمواد المضافة وتسلسل الحمض النووي النموذجي. توفر ثلاثي فوسفات النيوكليوتيدات (NTPs) مصدر الطاقة الأساسي لدفع الحمض النووي الريبي المرسال الأولي (ATP و GTP و CTP و UTP) وتخليق البروتين (ATP و GTP فقط). لزيادة غلة TX-TL ، يتم تجديد NTPs من خلال هدم مصدر طاقة ثانوي ، مثل maltose14 و maltodextrin15 و glucose14 و 3-phosphoglycerate (3-PGA)16 و phosphoenolpyruvate17 و L-glutamate18. هذا النشاط الأيضي المتأصل متعدد الاستخدامات بشكل مدهش ، ولكنه لم يدرس بشكل جيد ، خاصة في أنظمة TX-TL الناشئة. لكل مصدر طاقة خصائص ومزايا متميزة من حيث إنتاجية ATP والاستقرار الكيميائي والتكلفة ، وهو اعتبار مهم لتفاعلات TX-TL الموسعة. وحتى الآن، وصلت البروتوكولات الحالية للإشريكية القولونية TX-TL إلى 4.0 ملغم/مل (~ 157 ميكرومتر) لنموذج بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP)، باستخدام مزيج من 3-PGA (30 ملليمتر)، والمالتوديكسترين (60 ملليمتر)، والريبوز D (30 ملليمتر) كمصدر ثانوي للطاقة19.
في الآونة الأخيرة ، كان هناك اهتمام متزايد بدراسة مسارات التخليق الحيوي للمستقلب الثانوي في أنظمة TX-TL20،21،22. على وجه التحديد ، تعد الأكتينوباكتيريا مصدرا رئيسيا للمستقلبات الثانوية ، بما في ذلك المضادات الحيوية والمواد الكيميائية الزراعية23,24. يتم إثراء جينوماتها بما يسمى مجموعات الجينات الاصطناعية الحيوية (BGCs) ، والتي تشفر المسارات الأنزيمية للتخليق الحيوي المستقلب الثانوي. لدراسة الأجزاء الوراثية للبكتيريا الأكتينوباكتيريا ومسارات التخليق الحيوي ، تم مؤخرا تطوير مجموعة من أنظمة TX-TL القائمة على العقديات 5،6،25،26. من المحتمل أن تكون أنظمة Streptomyces TX-TL المتخصصة هذه مفيدة للأسباب التالية: [1] توفير بيئة قابلة للطي للبروتين الأصلي للإنزيمات من Streptomyces spp.26 ؛ [2] الوصول إلى تجمع tRNA الأمثل للتعبير الجيني G + C (٪) العالي ؛ [3] الأيض الأولي النشط، الذي يحتمل اختطافه لتوريد سلائف التخليق الأحيائي؛ و [4] توفير الإنزيمات أو السلائف أو العوامل المساعدة من التمثيل الغذائي الثانوي الموجود في مستخلص الخلايا الأصلي. ومن ثم، فقد تم مؤخرا إنشاء مجموعة أدوات S.venezuelae TX-TL عالية الإنتاجية لتسخير هذه القدرات الفريدة5.
Streptomyces venezuelae هو مضيف ناشئ للبيولوجيا التركيبية مع تاريخ غني في التكنولوجيا الحيوية الصناعية5،27،28،29 وكنظام نموذجي لدراسة انقسام الخلايا والتنظيم الجيني في Actinobacteria30،31،32. تحتوي سلالة النوع الرئيسي ، S. venezuelae ATCC 10712 ، على جينوم كبير نسبيا يبلغ 8.22 ميجا بايت مع محتوى G + C بنسبة 72.5٪ (٪) (رقم الانضمام: CP029197) ، والذي يشفر تسلسل ترميز 7377 ، و 21 rRNAs ، و 67 tRNAs ، و 30 مجموعة جينية اصطناعية حيوية27. في البيولوجيا التركيبية ، S. venezuelae ATCC 10712 هو هيكل جذاب للتعبير غير المتجانس عن مسارات التخليق الحيوي. على عكس معظم بقع العقديات الأخرى ، فإنه يوفر العديد من المزايا الرئيسية ، بما في ذلك وقت المضاعفة السريع (~ 40 دقيقة) ، ومجموعة واسعة من الأدوات الوراثية والتجريبية5,28 ، ونقص التكتل الفطري ، والجراثيم في الوسائط السائلة28,33. وقد أظهرت العديد من الدراسات أيضا استخدام S. venezuelae للإنتاج غير المتجانس لمجموعة متنوعة من المستقلبات الثانوية ، بما في ذلك polyketides والببتيدات الريبوسومية وغير الريبوسومية 34،35،36،37،38. هذه الميزات مجتمعة تجعل هذه السلالة مضيف ميكروبي جذاب للبيولوجيا التركيبية وتطبيقات الهندسة الأيضية. في حين أن S. venezuelae ليس نموذج Streptomyces المهيمن للتعبير الجيني غير المتجانس ، مع مزيد من التطورات ، إلا أنه مستعد للاستخدام على نطاق أوسع في اكتشاف المنتجات الطبيعية.
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا (الشكل 1) لنظام S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية، والذي تم تحديثه من البروتوكول الأصلي المنشور سابقا26. في هذا العمل ، تم تحسين محلول الطاقة وظروف التفاعل لزيادة إنتاجية البروتين حتى 260 ميكروغرام / مل لبروتين مراسل mScarlet-I في تفاعل دفعة 4 ساعات ، 10 ميكرولتر ، باستخدام بلازميد قياسي ، pTU1-A-SP44-mScarlet-I. تم تصميم هذا البلازميد خصيصا لتمكين طرق مختلفة للكشف عن تعبير البروتين. كما تم تبسيط البروتوكول ، في حين تم تحسين نظام الطاقة لتقليل تعقيد وتكلفة إعداد تفاعلات خالية من الخلايا دون المساس بالعائد. جنبا إلى جنب مع نظام TX-TL الأمثل ، تم تطوير مكتبة من الأجزاء الوراثية لضبط التعبير الجيني الدقيق وكأدوات فلورسنت لمراقبة TX-TL في الوقت الفعلي ، وبالتالي إنشاء منصة متعددة الاستخدامات للنماذج الأولية للتعبير الجيني ومسارات التخليق الحيوي للمنتجات الطبيعية من Streptomyces spp. و Actinobacteria ذات الصلة.
في هذا العمل، يمكن استخدام البلازميد القياسي الموصى به (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) لإنشاء سير عمل S. venezuelae TX-TL في مختبر جديد وهو متاح على AddGene (انظر الجدول التكميلي S1). يوفر pTU1-A-SP44-mScarlet-I للمستخدم المرونة اللازمة لدراسة إطارات القراءة المفتوحة الأخرى (ORFs). تم تحسين mScarlet-I ORF من الكودون للتعبير الجيني S. venezuelae. مروج SP44 هو مروج تأسيسي قوي نشط للغاية في كل من الإشريكية القولونية والستربتومايسيس spp.39. يحتوي البلازميد على موقعين فريدين لإنزيم التقييد (NdeI ، BamHI) للسماح بالاستنساخ الفرعي ل ORFs الجديدة في الإطار مع علامة FLAG-TERMINAL مشتركة ونظام علامة رابط الفلوريسين الزرنيخي (FlAsH). بدلا من ذلك ، يمكن إزالة كلتا العلامتين بإدراج كودون توقف بعد استنساخ جين جديد. مع هذا المتجه الأساسي ، تم إثبات التعبير عالي الغلة لمجموعة من البروتينات ، وهي البروتينات من مسار التخليق الحيوي لأوكسي تتراسيكلين ومركب الببتيد غير الريبوسومي غير المميز (NRPS) من العقدية ريموسوس (الشكل 2). من حيث الكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال ، يحتوي البلازميد القياسي pTU1-A-SP44-mScarlet-I على أبتامر dBroccoli (في المنطقة 3′-untranslated) للكشف باستخدام مسبار 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI). لزيادة المرونة، تم أيضا توفير مجموعة أدوات من أجزاء MoClo المتوافقة مع EcoFlex40 على AddGene، بما في ذلك متجه مكوك العقديات المتوافق مع EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) ومجموعة من البلازميدات المتغيرة pTU1-A-SP44 التي تعبر عن بروتين الفلور الأخضر الفائق (sfGFP) و mScarlet-I و mVenus-I و β-glucuronidase (GUS). على وجه الخصوص ، يشتق بلازميد pSF1C-A من pAV-gapdh28 ويتم علاجه من مواقع BsaI / BsmBI لتجميع MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP يعادل pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP من EcoFlex40 ولكنه يحتوي على وظائف إضافية للاقتران وتكامل الكروموسومات في العقديات spp. باستخدام نظام phiC31 integrase28.
تتضمن المرحلة الأولى من البروتوكول نمو S. venezuelae ATCC 10712 أو سلالة وثيقة الصلة ، وحصاد الخلايا في المرحلة الأسية المتوسطة ، وخطوات غسل الخلايا ، والتوازن في المخازن المؤقتة S30A و S30B. تتطلب هذه المرحلة ثلاثة أيام ، ويمكن استخدام وقت نمو الخلايا لإعداد المكونات المتبقية كما هو موضح أدناه. ثم يتم تحليل الخلايا المحصودة عن طريق الصوتنة ، وتوضيحها ، وتخضع لتفاعل الجريان السطحي. في هذه المرحلة النهائية من التحضير ، يمكن تحضير مستخلصات الخلايا للتخزين على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية لتقليل فقدان النشاط. لتجميع تفاعلات TX-TL باستخدام هذا البروتوكول ، يتم تقديم Streptomyces Master Mix (SMM) ، مع خيار تنسيق الحد الأدنى من حلول الطاقة (MES) الذي يعطي عوائد مماثلة. علاوة على ذلك ، يوصى بربط ثقافة جديدة من S. venezuelae ATCC 10712 من مخزون الجلسرين -80 درجة مئوية على صفيحة أجار GYM واحتضانها عند 28 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة على الأقل حتى تكون المستعمرات المفردة مرئية. يجب استخدام الثقافات الطازجة فقط للخطوات التالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المخطوطة، تم وصف بروتوكول S. venezuelae TX-TL عالي الإنتاجية بخطوات مفصلة يسهل إجراؤها لكل من المستخدمين ذوي الخبرة والجدد لأنظمة TX-TL. تمت إزالة العديد من الميزات من بروتوكولات Streptomyces45 و E. coli TX-TL41 الحالية لإنشاء بروتوكول الحد الأدنى ، ولكنه عالي الإنتاجية ل S. ven…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعترفوا بالدعم البحثي التالي: EPSRC [EP/K038648/1] ل SJM كPSR مع PSF. قامت Wellcome Trust برعاية زمالة ISSF ل SJM مع PSF في إمبريال كوليدج لندن. منحة الجمعية الملكية البحثية [RGS\R1\191186]; جائزة Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] ل SJM في جامعة كينت؛ ومنحة الدكتوراه من صندوق أبحاث التحديات العالمية (GCRF) ل KC في جامعة كينت.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
Referências
- Carbonell, P., et al. An automated Design-Build-Test-Learn pipeline for enhanced microbial production of fine chemicals. Communications Biology. 1, 66 (2018).
- Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods Protocols. 2 (1), 24 (2019).
- Zimmerman, E. S., et al. Production of site-specific antibody-drug conjugates using optimized non-natural amino acids in a cell-free expression system. Bioconjugate Chemistry. 25 (2), 351-361 (2014).
- Wiegand, D. J., Lee, H. H., Ostrov, N., Church, G. M. Cell-free protein expression using the rapidly growing bacterium Vibrio natriegens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (145), e59495 (2019).
- Moore, S. J., et al. A Streptomyces venezuelae cell-free toolkit for synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 10 (2), 402-411 (2021).
- Xu, H., Liu, W. -. Q., Li, J. Translation related factors improve the productivity of a Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. ACS Synthetic Biology. 9 (5), 1221-1224 (2020).
- Yim, S. S., et al. Multiplex transcriptional characterizations across diverse bacterial species using cell-free systems. Molecular Systems Biology. 15 (8), 8875 (2019).
- Moore, S. J., et al. Rapid acquisition and model-based analysis of cell-free transcription-translation reactions from nonmodel bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (19), 4340-4349 (2018).
- Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production–a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
- Geertz, M., Shore, D., Maerkl, S. J. Massively parallel measurements of molecular interaction kinetics on a microfluidic platform. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (41), 16540-16545 (2012).
- McManus, J. B., Emanuel, P. A., Murray, R. M., Lux, M. W. A method for cost-effective and rapid characterization of engineered T7-based transcription factors by cell-free protein synthesis reveals insights into the regulation of T7 RNA polymerase-driven expression. Archives of Biochemistry and Biophysics. 674, 108045 (2019).
- McManus, J. B., et al. A method for cost-effective and rapid characterization of genetic parts. bioRxiv. , (2021).
- Park, J., Yim, S. S., Wang, H. H. High-throughput transcriptional characterization of regulatory sequences from bacterial Biosynthetic Gene Clusters. ACS Synthetic Biology. , (2021).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/ml of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
- Karim, A. S., Heggestad, J. T., Crowe, S. A., Jewett, M. C. Controlling cell-free metabolism through physiochemical perturbations. Metabolic Engineering. 45, 86-94 (2018).
- Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
- Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E. coli TXTL toolbox 3.0: New capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synthetic Biology. , (2021).
- Goering, A. W., et al. In vitro reconstruction of nonribosomal peptide biosynthesis directly from DNA using cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 39-44 (2017).
- Khatri, Y., et al. Multicomponent microscale biosynthesis of unnatural cyanobacterial indole alkaloids. ACS Synthetic Biology. 9 (6), 1349-1360 (2020).
- Zhuang, L., et al. Total in vitro biosynthesis of the nonribosomal macrolactone peptide valinomycin. Metabolic Engineering. 60, 37-44 (2020).
- Hoskisson, P. A., Seipke, R. F. Cryptic or silent? The known unknowns, unknown knowns, and unknown unknowns of secondary metabolism. mBio. 11 (5), 02642 (2020).
- Bentley, S. D., et al. Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2). Nature. 417 (6885), 141-147 (2002).
- Li, J., Wang, H., Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. Establishing a high yielding Streptomyces-based cell-free protein synthesis system. Biotechnology and Bioengineering. 114 (6), 1343-1353 (2017).
- Moore, S. J., Lai, H. -. E., Needham, H., Polizzi, K. M., Freemont, P. S. Streptomyces venezuelae TX-TL – a next generation cell-free synthetic biology tool. Biotechnology Journal. 12 (4), (2017).
- Kim, W., et al. Comparative genomics determines strain-dependent secondary metabolite production in Streptomyces venezuelae strains. Biomolecules. 10 (6), 864 (2020).
- Phelan, R. M., et al. Development of next generation synthetic biology tools for use in Streptomyces venezuelae. ACS Synthetic Biology. 6 (1), 159-166 (2017).
- Song, J. Y., et al. Complete genome sequence of Streptomyces venezuelae ATCC 15439, a promising cell factory for production of secondary metabolites. Journal of Biotechnology. 219, 57-58 (2016).
- Bush, M. J., Bibb, M. J., Chandra, G., Findlay, K. C., Buttner, M. J. Genes required for aerial growth, cell division, and chromosome segregation are targets of WhiA before sporulation in Streptomyces venezuelae. mBio. 4 (5), 00684 (2013).
- Schumacher, M. A., et al. The crystal structure of the RsbN-σBldN complex from Streptomyces venezuelae defines a new structural class of anti-σ factor. Nucleic Acids Research. 46 (14), 7405-7417 (2018).
- Ramos-León, F., et al. A conserved cell division protein directly regulates FtsZ dynamics in filamentous and unicellular actinobacteria. Elife. 10, 63387 (2021).
- Bush, M. J., Tschowri, N., Schlimpert, S., Flärdh, K., Buttner, M. J. c-di-GMP signalling and the regulation of developmental transitions in Streptomycetes. Nature Reviews. Microbiology. 13 (12), 749-760 (2015).
- Ehrlich, J., Gottlieb, D., Burkholder, P. R., Anderson, L. E., Pridham, T. G. Streptomyces venezuelae, n. sp., the source of chloromycetin. Journal of Bacteriology. 56 (4), 467-477 (1948).
- Inahashi, Y., et al. Watasemycin biosynthesis in Streptomyces venezuelae: thiazoline C-methylation by a type B radical-SAM methylase homologue. Chemical Science. 8 (4), 2823-2831 (2017).
- Jakeman, D. L., et al. Antimicrobial activities of jadomycin B and structurally related analogues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (3), 1245-1247 (2009).
- Kodani, S., Sato, K., Hemmi, H., Ohnish-Kameyama, M. Isolation and structural determination of a new hydrophobic peptide venepeptide from Streptomyces venezuelae. Journal of Antibiotics. 67 (12), 839-842 (2014).
- Akey, D. L., et al. Structural basis for macrolactonization by the pikromycin thioesterase. Nature Chemical Biology. 2 (10), 537-542 (2006).
- Bai, C., et al. Exploiting a precise design of universal synthetic modular regulatory elements to unlock the microbial natural products in Streptomyces. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (39), 12181-12186 (2015).
- Moore, S. J., et al. EcoFlex: A multifunctional MoClo kit for E. coli synthetic biology. ACS Synthetic Biology. 5 (10), 1059-1069 (2016).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Kim, D. M., Choi, C. Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnology Progress. 12 (5), 645-649 (1996).
- Liu, Y., Fritz, B. R., Anderson, M. J., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. Characterizing and alleviating substrate limitations for improved in vitro ribosome construction. ACS Synthetic Biology. 4 (4), 454-462 (2015).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nature Methods. 14, 53-56 (2017).
- Hopword, D. A., Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. Practical Streptomyces genetics. John Innes Foundation. , (2000).
- Hunter, D. J. B., Bhumkar, A., Giles, N., Sierecki, E., Gambin, Y. Unexpected instabilities explain batch-to-batch variability in cell-free protein expression systems. Biotechnology and Bioengineering. 115 (8), 1904-1914 (2018).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Hoff, G., Bertrand, C., Piotrowski, E., Thibessard, A., Leblond, P. Genome plasticity is governed by double strand break DNA repair in Streptomyces. Scientific Reports. 8, 5272 (2018).
- Bibb, M. J. Regulation of secondary metabolism in streptomycetes. Current Opinion in Microbiology. 8 (2), 208-215 (2005).
- Weber, T., et al. antiSMASH 3.0-a comprehensive resource for the genome mining of biosynthetic gene clusters. Nucleic Acids Research. 43 (1), 237-243 (2015).
- Navarro-Muñoz, J. C., et al. A computational framework to explore large-scale biosynthetic diversity. Nature Chemical Biology. 16, 60-68 (2020).
- Alanjary, M., et al. The Antibiotic Resistant Target Seeker (ARTS), an exploration engine for antibiotic cluster prioritization and novel drug target discovery. Nucleic Acids Research. 45 (1), 42-48 (2017).
- Medema, M. H., Fischbach, M. A. Computational approaches to natural product discovery. Nature Chemical Biology. 11 (9), 639-648 (2015).
- Whitford, C. M., Cruz-Morales, P., Keasling, J. D., Weber, T. The Design-Build-Test-Learn cycle for metabolic engineering of Streptomycetes. Essays in Biochemistry. , (2021).
