Une boîte à outils de transcription-traduction de streptomyces à haut rendement pour la biologie synthétique et les applications de produits naturels
Summary
Ce protocole détaille une méthode améliorée pour synthétiser des rendements élevés de protéines recombinantes à partir d’un système de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) de Streptomyces venezuelae .
Abstract
Streptomyces spp. sont une source majeure d’antibiotiques cliniques et de produits chimiques industriels. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 est une souche à croissance rapide et un producteur naturel de chloramphénicol, de jadomycine et de pikromycine, ce qui en fait un candidat attrayant en tant que châssis de biologie synthétique de nouvelle génération. Par conséquent, les outils génétiques qui accélèrent le développement de S. venezuelae ATCC 10712, ainsi que d’autres modèles Streptomyces spp., sont hautement souhaitables pour l’ingénierie et la découverte de produits naturels. À cette fin, un système dédié sans cellules S. venezuelae ATCC 10712 est fourni dans ce protocole pour permettre l’expression hétérologue à haut rendement des gènes G + C élevés (%) Ce protocole convient aux réactions par lots à petite échelle (10-100 μL) dans un format de plaque de 96 puits ou de 384 puits, tandis que les réactions sont potentiellement évolutives. Le système sans cellules est robuste et peut atteindre des rendements élevés (~ 5-10 μ M) pour une gamme de protéines recombinantes dans une configuration minimale. Ce travail intègre également un large ensemble d’outils plasmidiques pour la mesure en temps réel de la synthèse de l’ARNm et des protéines, ainsi que la coloration par fluorescence dans le gel des protéines marquées. Ce protocole peut également être intégré à des flux de travail de caractérisation de l’expression génique à haut débit ou à l’étude des voies enzymatiques des gènes G +C (%) élevés présents dans les génomes des Actinomycètes.
Introduction
Les systèmes de transcription-traduction sans cellule (TX-TL) fournissent une plate-forme de prototypage idéale pour la biologie synthétique afin de mettre en œuvre des cycles rapides de conception-construction-test-apprentissage, le cadre d’ingénierie conceptuelle pour la biologie synthétique1. En outre, les systèmes TX-TL suscitent un intérêt croissant pour la production de protéines recombinantes de grande valeur dans un environnement à réaction ouverte2, par exemple pour incorporer des acides aminés non standard dans des conjugués anticorps-médicament3. Plus précisément, TX-TL nécessite un extrait cellulaire, un plasmide ou un ADN linéaire et une solution énergétique pour catalyser la synthèse des protéines dans des réactions discontinues ou semi-continues. Alors qu’Escherichia coli TX-TL est le système dominant sans cellules, un certain nombre de systèmes TX-TL émergents non modèles ont attiré l’attention pour différentes applications4,5,6,7,8. Les principaux avantages du TX-TL incluent une évolutivité flexible (échelle nanolitre à litre)9,10, une forte reproductibilité et des flux de travail automatisés8,11,12. En particulier, l’automatisation du TX-TL permet la caractérisation accélérée des parties génétiques et des éléments régulateurs8,12,13.
En termes de configuration de la réaction, TX-TL nécessite des sources d’énergie primaires et secondaires, ainsi que des acides aminés, des cofacteurs, des additifs et une séquence d’ADN modèle. Les triphosphates nucléotidiques (NTP) fournissent la source d’énergie primaire pour piloter l’ARNm initial (ATP, GTP, CTP et UTP) et la synthèse des protéines (uniquement ATP et GTP). Pour augmenter les rendements TX-TL, les NTP sont régénérés par le catabolisme d’une source d’énergie secondaire, telle que le maltose14, la maltodextrine15, le glucose14, le 3-phosphoglycérate (3-PGA)16, le phosphoénolpyruvate17 et le L-glutamate18. Cette activité métabolique inhérente est étonnamment polyvalente, mais peu étudiée, en particulier dans les systèmes TX-TL émergents. Chaque source d’énergie a des propriétés et des avantages distincts en termes de rendement en ATP, de stabilité chimique et de coût, ce qui est une considération importante pour les réactions TX-TL à grande échelle. Jusqu’à présent, les protocoles actuels pour E. coli TX-TL ont atteint jusqu’à 4,0 mg/mL (~157 μM) pour la protéine fluorescente verte modèle (GFP), en utilisant un mélange de 3-PGA (30 mM), de maltodextrine (60 mM) et de D-ribose (30 mM) comme source d’énergie secondaire19.
Récemment, il y a eu un intérêt croissant pour l’étude des voies biosynthétiques des métabolites secondaires dans les systèmes TX-TL20,21,22. Plus précisément, les actinobactéries sont une source majeure de métabolites secondaires, y compris les antibiotiques et les produits chimiques agricoles23,24. Leurs génomes sont enrichis de groupes de gènes biosynthétiques (BGC), qui codent des voies enzymatiques pour la biosynthèse des métabolites secondaires. Pour l’étude des parties génétiques des actinobactéries et des voies biosynthétiques, une gamme de systèmes TX-TL à base de streptomyces a récemment été développée5,6,25,26. Ces systèmes spécialisés Streptomyces TX-TL sont potentiellement bénéfiques pour les raisons suivantes : [1] fourniture d’un environnement de repliement protéique natif pour les enzymes de Streptomyces spp.26 ; [2] accès à un pool d’ARNt optimal pour une expression génique G+C (%) élevée ; [3] métabolisme primaire actif, qui peut potentiellement être détourné pour la fourniture de précurseurs biosynthétiques; et [4] fourniture d’enzymes, de précurseurs ou de cofacteurs issus du métabolisme secondaire présents dans l’extrait de cellule native. Par conséquent, une boîte à outils S.venezuelae TX-TL à haut rendement a récemment été mise en place pour exploiter ces capacités uniques5.
Streptomyces venezuelae est un hôte émergent pour la biologie synthétique avec une riche histoire en biotechnologie industrielle5,27,28,29 et en tant que système modèle pour l’étude de la division cellulaire et de la régulation génétique chez les Actinobactéries30,31,32. La souche de type principal, S. venezuelae ATCC 10712, a un génome relativement grand de 8,22 Mb avec une teneur en G+C de 72,5% (%) (numéro d’acquisition: CP029197), qui code 7377 séquences codantes, 21 ARNr, 67 ARNt et 30 groupes de gènes biosynthétiques27. En biologie synthétique, S. venezuelae ATCC 10712 est un châssis attrayant pour l’expression hétérologue des voies biosynthétiques. Contrairement à la plupart des autres taches streptomyces, il offre plusieurs avantages clés, notamment un temps de doublement rapide (~ 40 min), une vaste gamme d’outils génétiques et expérimentaux5,28, l’absence d’agglutination mycélienne et la sporulation dans les milieux liquides28,33. Plusieurs études ont également démontré l’utilisation de S. venezuelae pour la production hétérologue d’un large éventail de métabolites secondaires, y compris les polycétides, les peptides ribosomiques et non ribosomaux34,35,36,37,38. Ces caractéristiques combinées font de cette souche un hôte microbien attrayant pour les applications de biologie synthétique et d’ingénierie métabolique. Bien que S. venezuelae ne soit pas le modèle dominant de Streptomyces pour l’expression des gènes hétérologues, avec d’autres développements, il est prêt pour une utilisation plus large dans la découverte de produits naturels.
Ce manuscrit présente un protocole détaillé (Figure 1) pour un système S. venezuelae TX-TL à haut rendement, qui a été mis à jour par rapport au protocole original précédemment publié26. Dans ce travail, la solution énergétique et les conditions de réaction ont été optimisées pour augmenter le rendement en protéines jusqu’à 260 μg/mL pour la protéine rapporteure mScarlet-I dans une réaction par lots de 4 h, 10 μL, en utilisant un plasmide standard, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Ce plasmide a été spécialement conçu pour permettre diverses méthodes de détection de l’expression des protéines. Le protocole est également rationalisé, tandis que le système énergétique a été optimisé pour réduire la complexité et le coût de la mise en place de réactions sans cellules sans compromettre le rendement. Parallèlement au système TX-TL optimisé, une bibliothèque de parties génétiques a été développée pour affiner l’expression des gènes et en tant qu’outils fluorescents pour surveiller TX-TL en temps réel, créant ainsi une plate-forme polyvalente pour le prototypage de l’expression génique et des voies biosynthétiques de produits naturels de Streptomyces spp. et d’Actinobactéries apparentées.
Dans ce travail, le plasmide standard recommandé (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) peut être utilisé pour établir le flux de travail S. venezuelae TX-TL dans un nouveau laboratoire et est disponible sur AddGene (voir le tableau supplémentaire S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I offre à l’utilisateur la flexibilité d’étudier d’autres cadres de lecture ouverts (ORF). L’ORF mScarlet-I est optimisé pour le codon pour l’expression du gène S. venezuelae. Le promoteur SP44 est un puissant promoteur constitutif qui est très actif chez E. coli et Streptomyces spp.39. Le plasmide possède deux sites enzymatiques de restriction uniques (NdeI, BamHI) pour permettre le sous-clonage de nouveaux ORF dans le cadre avec un marqueur FLAG C-terminal commun et un système d’étiquette de liant en épingle à cheveux arsenical de la fluorescéine (FlAsH). Alternativement, les deux étiquettes peuvent être retirées avec l’inclusion d’un codon stop après le sous-clonage d’un nouveau gène. Avec ce vecteur de base, l’expression à haut rendement d’une gamme de protéines a été démontrée, à savoir des protéines de la voie de biosynthèse de l’oxytétracycline et une peptide synthétase non ribosomale non caractérisée (NRPS) de Streptomyces rimosus (Figure 2). En termes de détection de l’ARNm, le plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I contient un aptamère dBroccoli (dans la région 3′-non traduite) pour la détection avec la sonde 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidène imidazolinone (DFHBI). Pour une flexibilité accrue, un ensemble d’outils de pièces MoClo compatibles EcoFlex40 a également été mis à disposition sur AddGene, y compris un vecteur navette Streptomyces compatible EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) et une gamme de plasmides variants pTU1-A-SP44 exprimant la protéine de fluorescence verte superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I et β-glucuronidase (GUS). En particulier, le plasmide pSF1C-A est dérivé de pAV-gapdh28 et est guéri des sites BsaI/BsmBI pour l’assemblage MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP est équivalent à pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP d’EcoFlex40 mais contient des fonctionnalités supplémentaires pour la conjugaison et l’intégration chromosomique dans Streptomyces spp. en utilisant le système d’intégration phiC3128.
La première étape du protocole implique la croissance de la S. venezuelae ATCC 10712 ou d’une souche étroitement apparentée, la récolte de cellules à mi-exponentielle, les étapes de lavage des cellules et l’équilibrage dans les tampons S30A et S30B. Cette étape nécessite trois jours et le temps nécessaire à la croissance cellulaire peut être utilisé pour préparer les composants restants comme décrit ci-dessous. Les cellules récoltées sont ensuite lysées par sonication, clarifiées et subissent une réaction de ruissellement. À cette étape finale de la préparation, les extraits cellulaires peuvent être préparés pour un stockage à long terme à -80 ° C afin de minimiser la perte d’activité. Pour l’assemblage des réactions TX-TL à l’aide de ce protocole, un Streptomyces Master Mix (SMM) est présenté, avec l’option d’un format MES (Minimal Energy Solution) qui donne des rendements comparables. En outre, il est recommandé de strier une culture fraîche de S. venezuelae ATCC 10712 à partir d’un stock de glycérol de -80 °C sur une plaque de gélose GYM et d’incuber à 28 °C pendant au moins 48 à 72 h jusqu’à ce que des colonies uniques soient visibles. Seules les cultures fraîches doivent être utilisées pour les étapes suivantes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce manuscrit, un protocole S. venezuelae TX-TL à haut rendement a été décrit avec des étapes détaillées qui sont simples à mener pour les utilisateurs expérimentés et nouveaux des systèmes TX-TL. Plusieurs caractéristiques des protocoles Streptomyces45 et E. coli TX-TL41 existants ont été supprimées pour établir un protocole minimal, mais à haut rendement pour S. venezuelae TX-TL5,26.</su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à souligner le soutien à la recherche suivant : EPSRC [EP/K038648/1] pour SJM en tant que PDRA avec PSF; Wellcome Trust a parrainé une bourse ISSF pour SJM avec PSF à l’Imperial College de Londres; Subvention de recherche de la Royal Society [RGS\R1\191186]; Prix Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] pour SJM à l’Université du Kent; et bourse de doctorat du Global Challenges Research Fund (GCRF) pour KC à l’Université du Kent.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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