सिंथेटिक जीव विज्ञान और प्राकृतिक उत्पाद अनुप्रयोगों के लिए एक उच्च उपज Streptomyces प्रतिलेखन-अनुवाद टूलकिट
Summary
यह प्रोटोकॉल एक Streptomyces वेनेजुएला सेल मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TX-TL) प्रणाली से पुनः संयोजक प्रोटीन की उच्च पैदावार को संश्लेषित करने के लिए एक बढ़ी हुई विधि का विवरण देता है।
Abstract
Streptomyces spp. नैदानिक एंटीबायोटिक दवाओं और औद्योगिक रसायनों का एक प्रमुख स्रोत हैं। Streptomyces वेनेजुएला ATCC 10712 एक तेजी से बढ़ता तनाव और क्लोरैम्फेनिकोल, जैडोमाइसिन और पिक्रोमाइसिन का एक प्राकृतिक उत्पादक है, जो इसे अगली पीढ़ी के सिंथेटिक जीव विज्ञान चेसिस के रूप में एक आकर्षक उम्मीदवार बनाता है। इसलिए, आनुवंशिक उपकरण जो एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 के विकास में तेजी लाते हैं, साथ ही साथ अन्य स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी मॉडल, प्राकृतिक उत्पाद इंजीनियरिंग और खोज के लिए अत्यधिक वांछनीय हैं। इस अंत तक, एक समर्पित एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 सेल-मुक्त प्रणाली इस प्रोटोकॉल में प्रदान की जाती है ताकि उच्च जी + सी (%) जीन की उच्च उपज हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति को सक्षम किया जा सके। यह प्रोटोकॉल छोटे पैमाने पर (10-100 μL) बैच प्रतिक्रियाओं के लिए या तो 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में उपयुक्त है, जबकि प्रतिक्रियाएं संभावित रूप से स्केलेबल हैं। सेल-मुक्त प्रणाली मजबूत है और एक न्यूनतम सेटअप में पुनः संयोजक प्रोटीन की एक श्रृंखला के लिए उच्च पैदावार (~ 5-10 μ एम) प्राप्त कर सकती है। इस काम में एमआरएनए और प्रोटीन संश्लेषण के वास्तविक समय के माप के लिए एक व्यापक प्लास्मिड टूलसेट भी शामिल है, साथ ही साथ टैग किए गए प्रोटीन के इन-जेल प्रतिदीप्ति धुंधला भी शामिल है। इस प्रोटोकॉल को उच्च-थ्रूपुट जीन अभिव्यक्ति लक्षण वर्णन वर्कफ़्लोज़ या एक्टिनोमाइसेट्स जीनोम में मौजूद उच्च जी + सी (%) जीन से एंजाइम मार्गों के अध्ययन के साथ भी एकीकृत किया जा सकता है।
Introduction
सेल-मुक्त प्रतिलेखन-अनुवाद (TX-TL) सिस्टम सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक आदर्श प्रोटोटाइप मंच प्रदान करते हैं ताकि तेजी से डिजाइन-बिल्ड-टेस्ट-लर्निंग चक्र, सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए वैचारिक इंजीनियरिंग ढांचा लागू किया जा सके। इसके अलावा, एक खुली प्रतिक्रिया वातावरण में उच्च-मूल्य पुनः संयोजक प्रोटीन उत्पादन के लिए टीएक्स-टीएल सिस्टम में रुचि बढ़ रही है2, उदाहरण के लिए, एंटीबॉडी-ड्रग संयुग्मों में गैर-मानक अमीनो एसिड को शामिल करने के लिए। विशेष रूप से, TX-TL को एक सेल निकालने, प्लास्मिड या रैखिक डीएनए, और बैच या अर्ध-निरंतर प्रतिक्रियाओं में प्रोटीन संश्लेषण को उत्प्रेरित करने के लिए एक ऊर्जा समाधान की आवश्यकता होती है। जबकि Escherichia coli TX-TL प्रमुख सेल-मुक्त प्रणाली है, कई उभरते हुए गैर-मॉडल TX-TL प्रणालियों ने विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए ध्यान आकर्षित किया है4,5,6,7,8। TX-TL के प्रमुख लाभों में लचीला स्केलेबिलिटी (नैनोलीटर से लीटर स्केल तक) 9,10, मजबूत पुनरुत्पादन, और स्वचालित वर्कफ़्लो8,11,12 शामिल हैं। विशेष रूप से, TX-TL का स्वचालन आनुवंशिक भागों और नियामक तत्वों के त्वरित लक्षण वर्णन की अनुमति देता है8,12,13।
प्रतिक्रिया सेटअप के संदर्भ में, TX-TL को प्राथमिक और माध्यमिक ऊर्जा स्रोतों दोनों की आवश्यकता होती है, साथ ही साथ अमीनो एसिड, cofactors, additives, और एक टेम्पलेट डीएनए अनुक्रम की आवश्यकता होती है। न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट (एनटीपी) प्रारंभिक एमआरएनए (एटीपी, जीटीपी, सीटीपी और यूटीपी) और प्रोटीन संश्लेषण (केवल एटीपी और जीटीपी) को चलाने के लिए प्राथमिक ऊर्जा स्रोत प्रदान करते हैं। TX-TL पैदावार को बढ़ाने के लिए, NTPs को एक माध्यमिक ऊर्जा स्रोत के catabolism के माध्यम से पुनर्जीवित किया जाता है, जैसे कि maltose14, maltodextrin15, glucose14, 3-phosphoglycerate (3-PGA)16, phosphoenolpyruvate17, और L-glutamate18। यह अंतर्निहित चयापचय गतिविधि आश्चर्यजनक रूप से बहुमुखी है, फिर भी खराब अध्ययन किया गया है, विशेष रूप से उभरते हुए टीएक्स-टीएल सिस्टम में। प्रत्येक ऊर्जा स्रोत में एटीपी उपज, रासायनिक स्थिरता और लागत के संदर्भ में अलग-अलग गुण और फायदे हैं, जो स्केल-अप टीएक्स-टीएल प्रतिक्रियाओं के लिए एक महत्वपूर्ण विचार है। अब तक, ई कोलाई TX-TL के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल मॉडल ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए 4.0 mg / mL (~ 157 μM) तक पहुंच गए हैं, जो 3-PGA (30 mM), माल्टोडेक्सट्रिन (60 mM), और D-ribose (30 mM) के मिश्रण का उपयोग करके द्वितीयक ऊर्जा स्रोत 19 के रूप में है।
हाल ही में, TX-TL systems20,21,22 में माध्यमिक मेटाबोलाइट बायोसिंथेटिक मार्गों का अध्ययन करने में बढ़ती रुचि रही है। विशेष रूप से, एक्टिनोबैक्टीरिया माध्यमिक चयापचयों का एक प्रमुख स्रोत है, जिसमें एंटीबायोटिक्स और कृषि रसायन शामिल हैं23,24। उनके जीनोम तथाकथित बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर (बीजीसी) से समृद्ध होते हैं, जो माध्यमिक मेटाबोलाइट जैवसंश्लेषण के लिए एंजाइमेटिक मार्गों को एन्कोड करते हैं। एक्टिनोबैक्टीरिया आनुवांशिक भागों और बायोसिंथेटिक मार्गों के अध्ययन के लिए, स्ट्रेप्टोमाइसेस-आधारित टीएक्स-टीएल प्रणालियों की एक श्रृंखला हाल ही में 5,6,25,26 विकसित की गई है। ये विशेष Streptomyces TX-TL सिस्टम निम्नलिखित कारणों से संभावित रूप से फायदेमंद हैं: [1] Streptomyces spp.26 से एंजाइमों के लिए एक देशी प्रोटीन तह वातावरण का प्रावधान; [2] उच्च जी + सी (%) जीन अभिव्यक्ति के लिए एक इष्टतम टीआरएनए पूल तक पहुंच; [3] सक्रिय प्राथमिक चयापचय, जो संभावित रूप से बायोसिंथेटिक अग्रदूतों की आपूर्ति के लिए अपहृत किया जा सकता है; और [4] देशी सेल निकालने में मौजूद द्वितीयक चयापचय से एंजाइमों, अग्रदूतों, या cofactors का प्रावधान। इसलिए, एक उच्च उपज S.venezuelae TX-TL टूलकिट हाल ही में इन अद्वितीय क्षमताओं का दोहन करने के लिए स्थापित किया गया है5.
Streptomyces वेनेजुएला औद्योगिक जैव प्रौद्योगिकी में एक समृद्ध इतिहास के साथ सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक उभरते मेजबान है5,27,28,29 और Actinobacteria30,31,32 में सेल विभाजन और आनुवंशिक विनियमन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में। मुख्य प्रकार के तनाव, एस वेनेज़ुएला एटीसीसी 10712, में 72.5% जी + सी सामग्री (%) (परिग्रहण संख्या: CP029197) के साथ 8.22 Mb का अपेक्षाकृत बड़ा जीनोम है, जो 7377 कोडिंग अनुक्रमों, 21 rRNAs, 67 tRNA, और 30 बायोसिंथेटिक जीन क्लस्टर27 को एन्कोड करता है। सिंथेटिक जीव विज्ञान में, एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 बायोसिंथेटिक मार्गों की हेटरोलॉगस अभिव्यक्ति के लिए एक आकर्षक चेसिस है। अधिकांश अन्य Streptomyces दाग के विपरीत, यह कई प्रमुख लाभ प्रदान करता है, जिसमें तेजी से दोहरीकरण समय (~ 40 मिनट), आनुवंशिक और प्रयोगात्मक उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला 5,28, माइसिलियल क्लंपिंग की कमी, और तरल मीडिया 28,33 में स्पोरुलेशन शामिल है। कई अध्ययनों ने माध्यमिक चयापचयों की एक विविध सरणी के हेटरोलॉगस उत्पादन के लिए एस वेनेज़ुएला के उपयोग का भी प्रदर्शन किया है, जिसमें पॉलीकेटाइड्स, राइबोसोमल और नॉनराइबोसोमल पेप्टाइड्स 34,35,36,37,38 शामिल हैं। ये संयुक्त विशेषताएं इस तनाव को सिंथेटिक जीव विज्ञान और चयापचय इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए एक आकर्षक माइक्रोबियल होस्ट बनाती हैं। जबकि एस वेनेजुएला हेटरोलॉगस जीन अभिव्यक्ति के लिए प्रमुख स्ट्रेप्टोमाइसेस मॉडल नहीं है, आगे के विकास के साथ, यह प्राकृतिक उत्पाद खोज के भीतर व्यापक उपयोग के लिए प्राइमेड है।
यह पांडुलिपि एक उच्च उपज एस वेनेजुएला TX-TL प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल (चित्रा 1) प्रस्तुत करता है, जिसे मूल पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल 26 से अपडेट किया गया है। इस काम में, ऊर्जा समाधान और प्रतिक्रिया की स्थिति को एक मानक प्लास्मिड, pTU1-A-SP44-mScarlet-I-mScarlet-I का उपयोग करके mScarlet-I रिपोर्टर प्रोटीन के लिए 260 μg / mL तक प्रोटीन उपज बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया गया है। इस प्लास्मिड को विशेष रूप से प्रोटीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के विभिन्न तरीकों को सक्षम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। प्रोटोकॉल को भी सुव्यवस्थित किया गया है, जबकि ऊर्जा प्रणाली को उपज से समझौता किए बिना सेल-मुक्त प्रतिक्रियाओं की स्थापना की जटिलता और लागत को कम करने के लिए अनुकूलित किया गया है। अनुकूलित TX-TL प्रणाली के साथ, आनुवंशिक भागों की एक लाइब्रेरी को ठीक-ट्यूनिंग जीन अभिव्यक्ति के लिए और वास्तविक समय में TX-TL की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट टूल के रूप में विकसित किया गया है, जिससे प्रोटोटाइप जीन अभिव्यक्ति और प्राकृतिक उत्पाद बायोसिंथेटिक मार्गों के लिए एक बहुमुखी मंच का निर्माण किया गया है।
इस काम में, अनुशंसित मानक प्लास्मिड (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) का उपयोग एक नई प्रयोगशाला में S. वेनेजुएला TX-TL वर्कफ़्लो स्थापित करने के लिए किया जा सकता है और AddGene पर उपलब्ध है (पूरक तालिका S1 देखें)। pTU1-A-SP44-mScarlet-I उपयोगकर्ता को अन्य ओपन-रीडिंग फ्रेम (ORFs) का अध्ययन करने के लिए लचीलापन प्रदान करता है। MScarlet-I ORF S. वेनेजुएला जीन अभिव्यक्ति के लिए कोडोन-अनुकूलित है। SP44 प्रमोटर एक मजबूत संवैधानिक प्रमोटर है जो ई कोलाई और स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी.39 दोनों में अत्यधिक सक्रिय है। प्लास्मिड में दो अद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम साइटें (NdeI, BamHI) हैं जो एक संयुक्त सी-टर्मिनल फ्लैग-टैग और फ्लोरोसीन आर्सेनिकल हेयरपिन (FlAsH) बाइंडर टैग सिस्टम के साथ नए ORFs के इन-फ्रेम के उप-क्लोनिंग की अनुमति देती हैं। वैकल्पिक रूप से, दोनों टैग को एक नए जीन को उप-क्लोनिंग के बाद एक स्टॉप कोडोन को शामिल करने के साथ हटाया जा सकता है। इस आधार वेक्टर के साथ, प्रोटीन की एक श्रृंखला की उच्च उपज अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया गया है, अर्थात् ऑक्सीटेट्रासाइक्लिन बायोसिंथेसिस मार्ग से प्रोटीन और स्ट्रेप्टोमाइसेस रिमोसस (चित्रा 2) से एक अनिर्दिष्ट नॉनराइबोसोमल पेप्टाइड सिंथेटेज (एनआरपीएस)। एमआरएनए का पता लगाने के संदर्भ में, pTU1-A-SP44-mScarlet-I मानक प्लास्मिड में 3,5-difluoro-4-hydroxybenzylidene imidazolinone (DFHBI) जांच के साथ पता लगाने के लिए एक dBroccoli aptimaterer (3′-untranleded क्षेत्र में) होता है। बढ़े हुए लचीलेपन के लिए, EcoFlex40-संगत MoClo भागों का एक टूलसेट भी AddGene पर उपलब्ध कराया गया है, जिसमें EcoFlex-संगत Streptomyces शटल वेक्टर (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) और pTU1-A-SP44 वेरिएंट प्लास्मिड की एक श्रृंखला शामिल है जो सुपरफ़ोल्डर ग्रीन फ्लोरोसेंस प्रोटीन (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I, और β-glucuronidase (GUS) को व्यक्त करती है। विशेष रूप से, pSF1C-A प्लास्मिड pAV-gapdh28 से व्युत्पन्न है और MoClo असेंबली के लिए BsaI / BsmBI साइटों से ठीक हो जाता है। pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP EcoFlex40 से pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP के बराबर है, लेकिन इसमें स्ट्रेप्टोमाइसेस एसपीपी में संयुग्मन और क्रोमोसोमल एकीकरण के लिए अतिरिक्त कार्यक्षमता शामिल है। phiC31 integrase system28 का उपयोग करना।
प्रोटोकॉल के पहले चरण में एस वेनेज़ुएला एटीसीसी 10712 या एक निकटसे संबंधित तनाव, मध्य-घातीय चरण में सेल फसल, सेल धोने के चरणों और S30A और S30B बफर में संतुलन शामिल है। इस चरण में तीन दिनों की आवश्यकता होती है, और सेल विकास के लिए समय का उपयोग शेष घटकों को तैयार करने के लिए किया जा सकता है जैसा कि नीचे वर्णित है। काटी गई कोशिकाओं को तब sonication द्वारा lysed किया जाता है, स्पष्ट किया जाता है, और एक रन-ऑफ प्रतिक्रिया से गुजरना पड़ता है। तैयारी के इस अंतिम चरण में, सेल अर्क को गतिविधि के नुकसान को कम करने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक भंडारण के लिए तैयार किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके TX-TL प्रतिक्रियाओं की असेंबली के लिए, एक Streptomyces मास्टर मिक्स (SMM) प्रस्तुत किया जाता है, जिसमें न्यूनतम ऊर्जा समाधान प्रारूप (एमईएस) का विकल्प होता है जो तुलनीय पैदावार देता है। इसके अलावा, यह एक जिम अगर प्लेट पर एक -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से एस वेनेजुएला एटीसीसी 10712 की एक ताजा संस्कृति लकीर की सिफारिश की है और कम से कम 48-72 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें जब तक कि एकल उपनिवेश दिखाई नहीं देते हैं। निम्नलिखित चरणों के लिए केवल ताजा संस्कृतियों का उपयोग किया जाना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि में, एक उच्च उपज एस वेनेजुएला टीएक्स-टीएल प्रोटोकॉल को विस्तृत चरणों के साथ वर्णित किया गया है जो टीएक्स-टीएल सिस्टम के अनुभवी और नए उपयोगकर्ताओं दोनों के लिए आचरण करने के लिए सरल हैं। ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निम्नलिखित शोध समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: पीएसएफ के साथ पीडीआरए के रूप में एसजेएम के लिए ईपीएसआरसी [ईपी / के 038648/1]; वेलकम ट्रस्ट ने इंपीरियल कॉलेज लंदन में पीएसएफ के साथ एसजेएम के लिए आईएसएसएफ फैलोशिप प्रायोजित की; रॉयल सोसायटी अनुसंधान अनुदान [RGS\R1\191186]; केंट विश्वविद्यालय में एसजेएम के लिए वेलकम ट्रस्ट सीड पुरस्कार [217528 / जेड / 19 / जेड] ; और केंट विश्वविद्यालय में केसी के लिए ग्लोबल चैलेंजेस रिसर्च फंड (जीसीआरएफ) पीएचडी छात्रवृत्ति।
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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