Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per la biologia sintetica e le applicazioni dei prodotti naturali
Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo avanzato per sintetizzare alte rese di proteine ricombinanti da un sistema di trascrizione senza cellule streptomyces venezuelae (TX-TL).
Abstract
Streptomyces spp. sono una delle principali fonti di antibiotici clinici e prodotti chimici industriali. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 è una varietà in rapida crescita e un produttore naturale di cloramfenicolo, jadomicina e pikromicina, il che lo rende un candidato attraente come telaio di biologia sintetica di prossima generazione. Pertanto, gli strumenti genetici che accelerano lo sviluppo di S. venezuelae ATCC 10712, così come altri modelli di Streptomyces spp., sono altamente desiderabili per l’ingegneria e la scoperta di prodotti naturali. A tal fine, in questo protocollo viene fornito un sistema S . venezuelae ATCC 10712 privo di cellule dedicato per consentire l’espressione eterologa ad alto rendimento di geni ad alto G + C (%). Questo protocollo è adatto per reazioni batch su piccola scala (10-100 μL) in formato piastra a 96 pozzetti o 384 pozzetti, mentre le reazioni sono potenzialmente scalabili. Il sistema privo di cellule è robusto e può raggiungere rese elevate (~ 5-10 μ M) per una gamma di proteine ricombinanti in una configurazione minima. Questo lavoro incorpora anche un ampio set di strumenti plasmidici per la misurazione in tempo reale dell’mRNA e della sintesi proteica, nonché la colorazione a fluorescenza in gel delle proteine marcate. Questo protocollo può anche essere integrato con flussi di lavoro di caratterizzazione dell’espressione genica ad alto rendimento o con lo studio di percorsi enzimatici da geni ad alto G + C (%) presenti nei genomi di Actinomiceti.
Introduction
I sistemi di trascrizione-traduzione senza cellule (TX-TL) forniscono una piattaforma di prototipazione ideale per la biologia sintetica per implementare cicli rapidi di progettazione-costruzione-test-apprendimento, il framework di ingegneria concettuale per la biologia sintetica1. Inoltre, vi è un crescente interesse per i sistemi TX-TL per la produzione di proteine ricombinanti di alto valore in un ambiente a reazione aperta2, ad esempio, per incorporare amminoacidi non standard nei coniugati anticorpo-farmaco3. In particolare, TX-TL richiede un estratto cellulare, plasmide o DNA lineare e una soluzione energetica per catalizzare la sintesi proteica in reazioni batch o semicontinue. Mentre Escherichia coli TX-TL è il sistema dominante senza cellule, un certo numero di sistemi TX-TL emergenti non modello hanno attirato l’attenzione per diverse applicazioni4,5,6,7,8. I principali vantaggi di TX-TL includono scalabilità flessibile (scala da nanolitri a litro)9,10, forte riproducibilità e flussi di lavoro automatizzati8,11,12. In particolare, l’automazione di TX-TL consente la caratterizzazione accelerata di parti genetiche ed elementi regolatori8,12,13.
In termini di configurazione della reazione, TX-TL richiede sia fonti di energia primaria che secondaria, nonché amminoacidi, cofattori, additivi e una sequenza di DNA modello. I nucleotidi trifosfati (NTP) forniscono la fonte di energia primaria per guidare l’mRNA iniziale (ATP, GTP, CTP e UTP) e la sintesi proteica (solo ATP e GTP). Per aumentare i rendimenti di TX-TL, gli NTP vengono rigenerati attraverso il catabolismo di una fonte di energia secondaria, come il maltosio14, la maltodestrina15, il glucosio14, il 3-fosfoglicerato (3-PGA)16, il fosfoenolpiruvato17 e il L-glutammato18. Questa attività metabolica intrinseca è sorprendentemente versatile, ma scarsamente studiata, specialmente nei sistemi TX-TL emergenti. Ogni fonte di energia ha proprietà e vantaggi distinti in termini di resa di ATP, stabilità chimica e costo, che è una considerazione importante per le reazioni TX-TL su larga scala. Finora, gli attuali protocolli per E. coli TX-TL hanno raggiunto fino a 4,0 mg / mL (~ 157 μM) per la proteina fluorescente verde modello (GFP), utilizzando una miscela di 3-PGA (30 mM), maltodestrina (60 mM) e D-ribosio (30 mM) come fonte di energia secondaria19.
Recentemente, c’è stato un crescente interesse nello studio delle vie biosintetiche dei metaboliti secondari nei sistemi TX-TL20,21,22. In particolare, gli Actinobatteri sono una delle principali fonti di metaboliti secondari, compresi antibiotici e prodotti chimici agricoli23,24. I loro genomi sono arricchiti con i cosiddetti cluster di geni biosintetici (BGC), che codificano percorsi enzimatici per la biosintesi del metabolita secondario. Per lo studio delle parti genetiche di Actinobacteria e delle vie biosintetiche, è stata recentemente sviluppata una serie di sistemi TX-TL basati su Streptomyces5,6,25,26. Questi sistemi specializzati Streptomyces TX-TL sono potenzialmente utili per i seguenti motivi: [1] fornitura di un ambiente di ripiegamento proteico nativo per gli enzimi di Streptomyces spp.26; [2] accesso a un pool di tRNA ottimale per un’elevata espressione genica G+C (%); [3] metabolismo primario attivo, che potenzialmente può essere dirottato per la fornitura di precursori biosintetici; e [4] fornitura di enzimi, precursori o cofattori dal metabolismo secondario presenti nell’estratto cellulare nativo. Pertanto, un toolkit S.venezuelae TX-TL ad alto rendimento è stato recentemente istituito per sfruttare queste capacità uniche5.
Streptomyces venezuelae è un ospite emergente per la biologia sintetica con una ricca storia nella biotecnologia industriale5,27,28,29 e come sistema modello per lo studio della divisione cellulare e della regolazione genetica in Actinobacteria30,31,32. Il ceppo di tipo principale, S. venezuelae ATCC 10712, ha un genoma relativamente grande di 8,22 Mb con il 72,5% di contenuto G + C (%) (numero di adesione: CP029197), che codifica 7377 sequenze codificanti, 21 rRNA, 67 tRNA e 30 cluster di geni biosintetici27. In biologia sintetica, S. venezuelae ATCC 10712 è un telaio attraente per l’espressione eterologa di vie biosintetiche. A differenza della maggior parte delle altre macchie di Streptomyces, offre diversi vantaggi chiave, tra cui un rapido tempo di raddoppio (~ 40 min), una vasta gamma di strumenti genetici e sperimentali5,28, mancanza di aggregazione miceliale e sporulazione in mezzi liquidi28,33. Diversi studi hanno anche dimostrato l’uso di S. venezuelae per la produzione eterologa di una vasta gamma di metaboliti secondari, tra cui polichetidi, peptidi ribosomiali e non ribostomali34,35,36,37,38. Queste caratteristiche combinate rendono questo ceppo un ospite microbico attraente per la biologia sintetica e le applicazioni di ingegneria metabolica. Mentre S. venezuelae non è il modello dominante di Streptomyces per l’espressione genica eterologa, con ulteriori sviluppi, è pronto per un uso più ampio all’interno della scoperta di prodotti naturali.
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato (Figura 1) per un sistema S. venezuelae TX-TL ad alto rendimento, che è stato aggiornato dal protocollo originale precedentemente pubblicato26. In questo lavoro, la soluzione energetica e le condizioni di reazione sono state ottimizzate per aumentare la resa proteica fino a 260 μg/mL per la proteina reporter mScarlet-I in una reazione batch di 4 ore, 10 μL, utilizzando un plasmide standard, pTU1-A-SP44-mScarlet-I. Questo plasmide è stato specificamente progettato per consentire vari metodi di rilevamento dell’espressione proteica. Anche il protocollo è semplificato, mentre il sistema energetico è stato ottimizzato per ridurre la complessità e il costo di impostare reazioni senza cellule senza compromettere la resa. Insieme al sistema TX-TL ottimizzato, è stata sviluppata una libreria di parti genetiche per la messa a punto dell’espressione genica e come strumenti fluorescenti per il monitoraggio di TX-TL in tempo reale, creando così una piattaforma versatile per la prototipazione dell’espressione genica e delle vie biosintetiche del prodotto naturale da Streptomyces spp. e relativi Actinobacteria.
In questo lavoro, il plasmide standard raccomandato (pTU1-A-SP44-mScarlet-I) può essere utilizzato per stabilire il flusso di lavoro S. venezuelae TX-TL in un nuovo laboratorio ed è disponibile su AddGene (vedere Tabella supplementare S1). pTU1-A-SP44-mScarlet-I offre all’utente la flessibilità di studiare altri frame a lettura aperta (ORF). L’ORF mScarlet-I è ottimizzato per il codone per l’espressione genica di S. venezuelae. Il promotore SP44 è un forte promotore costitutivo che è molto attivo sia in E. coli che in Streptomyces spp.39. Il plasmide ha due siti enzimatici di restrizione unici (NdeI, BamHI) per consentire la sub-clonazione di nuovi ORF in-frame con un sistema congiunto C-terminale FLAG-tag e fluorescein arsenical hairpin (FlAsH) binder tag. In alternativa, entrambi i tag possono essere rimossi con l’inclusione di un codone di arresto dopo la sub-clonazione di un nuovo gene. Con questo vettore di base, è stata dimostrata l’espressione ad alto rendimento di una gamma di proteine, vale a dire proteine della via di biosintesi dell’ossitetraciclina e una peptide sintetasi non ribosomiale non caratterizzata (NRPS) da Streptomyces rimosus (Figura 2). In termini di rilevamento dell’mRNA, il plasmide standard pTU1-A-SP44-mScarlet-I contiene un aptamero dBroccoli (nella regione 3′-non tradotto) per il rilevamento con la sonda 3,5-difluoro-4-idrossibenzilidene imidazolinone (DFHBI). Per una maggiore flessibilità, è stato reso disponibile anche un set di strumenti di parti MoClo compatibili con EcoFlex40 su AddGene, tra cui un vettore navetta Streptomyces compatibile con EcoFlex (pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP) e una gamma di plasmidi varianti pTU1-A-SP44 che esprimono la proteina di fluorescenza verde superfolder (sfGFP), mScarlet-I, mVenus-I e β-glucuronidasi (GUS). In particolare, il plasmide pSF1C-A è derivato da pAV-gapdh28 ed è polimerizzato di siti BsaI/BsmBI per l’assemblaggio MoClo. pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP è equivalente a pTU1-A-RFP/pTU2-A-RFP di EcoFlex40 ma contiene funzionalità aggiuntive per la coniugazione e l’integrazione cromosomica in Streptomyces spp. utilizzando il sistema di integrasi phiC3128.
La prima fase del protocollo prevede la crescita del S. venezuelae ATCC 10712 o di un ceppo strettamente correlato, la raccolta delle cellule in fase media-esponenziale, le fasi di lavaggio cellulare e l’equilibrio nei tamponi S30A e S30B. Questa fase richiede tre giorni e il tempo per la crescita cellulare può essere utilizzato per preparare i componenti rimanenti come descritto di seguito. Le cellule raccolte vengono quindi lisate mediante sonicazione, chiarificate e sottoposte a una reazione di deflusso. In questa fase finale della preparazione, gli estratti cellulari possono essere preparati per la conservazione a lungo termine a -80 °C per ridurre al minimo la perdita di attività. Per l’assemblaggio di reazioni TX-TL utilizzando questo protocollo, viene presentato uno Streptomyces Master Mix (SMM), con l’opzione di un formato MES (Minimal Energy Solution) che offre rese comparabili. Inoltre, si raccomanda di strisciare una coltura fresca di S. venezuelae ATCC 10712 da un brodo di glicerolo a -80 ° C su una piastra di agar GYM e incubare a 28 ° C per almeno 48-72 ore fino a quando non sono visibili singole colonie. Solo le colture fresche dovrebbero essere utilizzate per i seguenti passaggi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo manoscritto, è stato descritto un protocollo S. venezuelae TX-TL ad alto rendimento con passaggi dettagliati che sono semplici da condurre sia per gli utenti esperti che per quelli nuovi dei sistemi TX-TL. Diverse caratteristiche dei protocolli Streptomyces45 ed E. coli TX-TL41 esistenti sono state rimosse per stabilire un protocollo minimo, ma ad alto rendimento per S. venezuelae TX-TL5,26.<s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano riconoscere il seguente supporto alla ricerca: EPSRC [EP/K038648/1] per SJM come PDRA con PSF; Wellcome Trust ha sponsorizzato la borsa di studio ISSF per SJM con PSF presso l’Imperial College di Londra; Borsa di ricerca della Royal Society [RGS\R1\191186]; Premio Wellcome Trust SEED [217528/Z/19/Z] per SJM presso l’Università del Kent; e Global Challenges Research Fund (GCRF) Ph.D. borsa di studio per KC presso l’Università del Kent.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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