合成生物学と天然物アプリケーションのための高収量スト レプトマイス 転写翻訳ツールキット
Summary
このプロトコルは、 ストレプトマイセスベネズエラ 細胞非転写変換(TX-TL)システムから組み換えタンパク質の高収率を合成するための強化された方法を詳述する。
Abstract
ストレプトマイセス spp.は、臨床抗生物質および工業薬品の主要な供給源である。 ベネズエラのレンサトミース ATCC 10712は、成長が急速に進む菌株であり、クロラムフェニコール、ヒドマイシン、ピクロマイシンの天然生産者であり、次世代の合成生物学シャーシとして魅力的な候補です。したがって、 S.ベネズエラ ATCC 10712の開発を加速する遺伝的ツールは、他の ストレプトマイセス spp.モデルと同様に、天然物工学および発見のために非常に望ましい。この上、専用 のS.ベネズエラ ATCC 10712無細胞システムは、高G+C(%)遺伝子の高収率異種発現を可能にするために、このプロトコルに提供されています。このプロトコルは、96ウェルまたは384ウェルプレート形式の小規模(10-100 μL)バッチ反応に適していますが、反応はスケーラブルである可能性があります。無細胞システムは堅牢で、最小限のセットアップで組み換えタンパク質の範囲のための高収率(〜5-10 μ M)を達成することができます。また、mRNAやタンパク質合成のリアルタイム測定、タグ付きタンパク質のインゲル蛍光染色用の広範なプラスミドツールセットも組み込まれています。このプロトコルは、高スループットの遺伝子発現特性解析ワークフローや、アクチノマイセテスゲノムに存在する高G+C(%)遺伝子からの酵素経路の研究と統合することもできる。
Introduction
無細胞転写翻訳(TX-TL)システムは、合成生物学の概念的なエンジニアリングフレームワークである迅速な設計構築テスト学習サイクルを実装するための、合成生物学のための理想的なプロトタイピングプラットフォームを提供します。また、開放反応環境における高価値組換えタンパク質生産に対するTX-TLシステムへの関心が高まっている2は、例えば、抗体薬物コンジュゲート3に非標準アミノ酸を組み込む。具体的には、TX-TLは、細胞抽出物、プラスミドまたは線形DNA、およびバッチまたは半連続反応でタンパク質合成を触媒するエネルギー溶液を必要とする。エシェリヒア・コリTX-TLは、支配的な無細胞システムである一方で、多くの非モデルTX-TLシステムは、さまざまなアプリケーションのために注目を集めています 4,5,6,7,8.TX-TLの主な利点は、柔軟な拡張性(ナノリットルからリットルスケール)9,10、強力な再現性、自動化されたワークフロー8、11、12です。特に、TX-TLの自動化により、遺伝的部分および調節要素の加速的な特性評価が可能となる8,12,13.
反応のセットアップの面では、TX-TLは、一次および二次的なエネルギー源、ならびにアミノ酸、補因子、添加剤、およびテンプレートDNA配列の両方を必要とする。ヌクレオチド三リン酸(NTP)は、初期mRNA(ATP、GTP、CTP、およびUTP)およびタンパク質合成(ATPおよびGTPのみ)を駆動する一次エネルギー源を提供します。TX-TL収率を高めるために、NTPはマルトーゼ14、マルトデキストリン15、グルコース14、3-ホスホグリセリン酸(3-PGA)16、ホスホエノールピルビン酸17、L-グルタミン酸18などの二次エネルギー源の同化を通じて再生される。この固有の代謝活性は驚くほど多目的であり、特に新興のTX-TLシステムでは、まだ十分に研究されていません。各エネルギー源は、スケールアップTX-TL反応に重要な考慮すべきATP収量、化学的安定性、コストの点で、それぞれ異なる特性と利点を有します。これまでのところ、 大腸菌 TX-TLの電流プロトコルは、3-PGA(30 mM)、マルトデキストリン(60mM)、D-リボース(30mM)を二次エネルギー源として使用して、モデルグリーン蛍光タンパク質(GFP)で最大4.0mg/mL(約157μM)に達しています。
最近、TX-TLシステム20,21,22の二次代謝産物生合成経路の研究に対する関心が高まっています。具体的には、アクチノバクテリアは、抗生物質および農薬23,24を含む二次代謝産物の主要な供給源である。彼らのゲノムは、二次代謝産物生合成のための酵素経路をコードする、いわゆる生合成遺伝子クラスター(BGC)で濃縮されています。アクチノバクテリアの遺伝子部分と生合成経路の研究のために、ストレプトマイセスベースのTX-TLシステムの範囲が最近開発された5,6,25,26。これらの特殊なストレプトマイセスTX-TLシステムは、以下の理由で潜在的に有益である:[1]ストレプトマイセスspp.26からの酵素のための天然タンパク質折りたたみ環境の提供;[2] 高G+C(%)遺伝子発現に最適なtRNAプールへのアクセス;[3] 生合成前駆体の供給のためにハイジャックされる可能性のある活発な一次代謝;[4] 天然細胞抽出物に存在する二次代謝からの酵素、前駆体、または補因子の提供。したがって、これらのユニークな機能を活用するために、高収率S.ベネズエラTX-TLツールキットが最近設立されました5。
ストレプトミセスベネズエラは、工業バイオテクノロジーの豊富な歴史を持つ合成生物学の新たな宿主であり、アクチノバクテリア30,31,32の細胞分裂と遺伝子調節を研究するためのモデルシステムとして使用されています。主型のS.ベネズエラATCC 10712は、7377のコード配列、21rRNA、67 tRNA、および30個の生合成遺伝子クラスター27をコードする72.5%G+C含有量(加盟番号:CP029197)を有する8.22 Mbの比較的大きなゲノムを有する。合成生物学では、S. ベネズエラ ATCC 10712 は生合成経路の異種発現のための魅力的なシャーシです。他のほとんどのストレプトマイセス染色とは異なり、急速な倍倍時間(〜40分)、遺伝的および実験ツールの広範な範囲5,28、骨髄凝集の欠如、および液体培地における胞子形成を含むいくつかの重要な利点を提供する28,33。いくつかの研究はまた、ポリケチド、リボソームおよび非リボソームペプチド34、35、36、37、38を含む二次代謝産物の多様な配列の異種産生のためのS.ベネズエラの使用を実証している。これらの組み合わせの特徴は、この株は、合成生物学や代謝工学のアプリケーションのための魅力的な微生物宿主になります。S.ベネズエラは異種遺伝子発現の支配的なストレプトマイセスモデルではありませんが、さらなる発展に伴い、天然物発見におけるより広範な使用のために準備されています。
この原稿は、以前に公開された元のプロトコル26から更新された高収率S.ベネズエラTX-TLシステムの詳細なプロトコル(図1)を提示する。この研究では、エネルギー溶液と反応条件が最適化され、標準プラスミドpTU1-A-SP44-mScarlet-Iを用いた4時間、10μLバッチ反応でmScarlet-Iレポータータンパク質のタンパク質収量を最大260μg/mLに増加させます。このプラスミドは、タンパク質発現を検出する様々な方法を有効にするように特別に設計されています。このプロトコルも合理化され、エネルギーシステムは、収量を損なうことなく無細胞反応を設定する複雑さとコストを削減するために最適化されています。最適化されたTX-TLシステムに加えて、遺伝子発現を微調整し、TX-TLをリアルタイムでモニタリングするための蛍光ツールとして開発された遺伝部分のライブラリを開発し、ストレプトマイセスspp.および関連するアクチノバクテリアからの遺伝子発現および天然物生合成経路を試作するための汎用性の高いプラットフォームを作成しました。
この研究では、推奨標準プラスミド(pTU1-A-SP44-mScarlet-I)を使用して、新しい実験室でS.ベネズエラTX-TLワークフローを確立し、AddGeneで利用可能です(補足表S1を参照)。pTU1-A-SP44-mScarlet-I は、他のオープンリーディングフレーム (ORF) を柔軟に学習できます。mScarlet-I ORFは、S.ベネズエラ遺伝子発現に対してコドン最適化されています。SP44プロモーターは、大腸菌およびストレプトマイセスspp.39の両方で高活性である強力な構成プロモーターです。プラスミドは、2つのユニークな制限酵素部位(NdeI、BamHI)を有し、C末端FLAGタグとフルオレセインアーセニカルヘアピン(FlAsH)バインダータグシステムを有する新しいORFをフレーム内でサブクローニングすることを可能にする。あるいは、両方のタグを、新しい遺伝子をサブクローニングした後に停止コドンを含めて除去することができる。この塩基ベクターにより、様々なタンパク質の高収率発現、すなわち、オキシテトラサイクリン生合成経路からのタンパク質と、ストレプトマイセスリモサスからの非リボソームペプチド合成酵素(NRPS)の発現が実証されている(図2)。mRNA検出の観点から、pTU1-A-SP44-mScarlet-I標準プラスミドは、3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリニヨン(DFHBI)プローブで検出するためのdBroccoliアプタマー(3’未翻訳領域)を含んでいます。柔軟性を高めるために、EcoFlex40互換のMoClo部品のツールセットもAddGeneで利用可能になりました。 EcoFlex互換ストレプトマイセスシャトルベクター(pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFP)およびスーパーフォルダグリーン蛍光タンパク質(sfGFP)を発現するpTU1-A-SP44変異プラスミドの範囲、mScarlet-I、mVenus-I、β-グルクリダーゼ(GUS)を含む。特に、pSF1C-AプラスミドはpAV-gapdh28に由来し、MoCloアセンブリのBsaI/BsmBI部位を硬化する。pSF1C-A-RFP/pSF2C-A-RFPはEcoFlex40のpTU1-A-RFP/pTU2-A-RFPに相当しますが、ストレプトマイセスsppの共役および染色体統合のための追加機能が含まれています。phiC31インテグラーゼシステム28を使用して。
プロトコルの第1段階は 、S.ベネズエラATCC 10712または密接に関連株の成長、中指数相での細胞収穫、細胞洗浄ステップ、およびS30AおよびS30Bバッファーの平衡化を含む。この段階は3日を要し、細胞増殖の時間は、以下に説明するように残りの成分を調製するために使用することができる。採取した細胞は、超音波処理によって分解され、明確化され、流出反応を受ける。この調製の最終段階では、細胞抽出物を-80°Cで長期保存して活性の損失を最小限に抑えることができます。このプロトコルを使用したTX-TL反応の組み立てでは、スト レプトマイセス マスターミックス(SMM)が提示され、同等の収率を与える最小エネルギー溶液フォーマット(MES)のオプションが表示されます。さらに、S .ベネズエラ ATCC 10712の新鮮な培養物を-80°CグリセロールストックからGYM寒天プレートにストリークし、28°Cで少なくとも48〜72時間インキュベートして、単一のコロニーが見えるまで推奨されます。次の手順では、新鮮なカルチャのみを使用する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、高収率のS.ベネズエラTX-TLプロトコルは、TX-TLシステムの経験豊富なユーザーと新しいユーザーの両方のために行う簡単な詳細な手順で説明されています。既存のストレプトマイセス45および大腸菌TX-TL41プロトコルからいくつかの機能が削除され、S.ベネズエラTX-TL5,26の最小かつ高収率プロトコルが</sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、PSFを持つPDRAとしてのSJMのためのEPSRC[EP/K038648/1]の研究支援を認めたいと思います。ウェルカムトラストは、インペリアル・カレッジ・ロンドンのPSFとSJMのためのISSFフェローシップを後援しました。王立協会研究助成金[RGS\R1\191186];ケント大学のSJMに対するウェルカムトラストSEEDアワード[217528/Z/19/Z]。そして、グローバルチャレンジ研究基金 (GCRF) ケント大学のKCのための博士号の奨学金.
Materials
| 2.5 L UltraYield Flask | Thomson | 931136-B | |
| 3-PGA (>93%) | Sigma | P8877 | |
| 384 Well Black/Clear Bottom Plate | ThermoFisher | 10692202 | |
| Ammonium chloride (98%) | Fluorochem | 44722 | |
| ATP, CTP, UTP, GTP (100 mM solution, >99%) | ThermoFisher | R0481 | |
| Carbenicillin (contact supplier for purity) | Melford | C46000-25.0 | |
| D-(+)-glucose (contact supplier for purity) | Melford | G32040 | |
| DFHBI (≥98% – HPLC) | Sigma | SML1627 | |
| DTT (contact supplier for purity) | Melford | MB1015 | |
| FlAsH-EDT2 (contact supplier for purity) | Santa Cruz Biotech | sc-363644 | |
| Glucose-6-phosphate (>98%) | Sigma | G7879 | |
| HEPES Free Acid (contact supplier for purity) | Melford | B2001 | |
| L-glutamic acid hemimagnesium salt tetrahydrate (>98%) | Sigma | 49605 | |
| Magnesium chloride (98%) | Fluorochem | 494356 | |
| Malt extract | Sigma | 70167-500G | |
| PEG-6000 | Sigma | 807491 | |
| Pierce 96-well Microdialysis Plate, 10K MWCO | ThermoFisher | 88260 | |
| Poly(vinyl sulfate) potassium salt | Sigma | 271969 | |
| Potassium glutamate (>99%) | Sigma | G1149 | |
| RTS amino acid sampler | 5 Prime | 2401530 | |
| Sodium chloride (99%) | Fluorochem | 94554 | |
| Supelclean LC-18 SPE C-18 SPE column (1 g) | Sigma | 505471 | |
| Yeast Extract | Melford | Y1333 | |
| Equipment | |||
| Platereader | BMG | Omega |
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