Denne protokollen presenterer eksperimentelle prosedyrer for å utføre vedheft fotavtrykk analysen for å avbilde vedheft hendelser under rask celle rullende vedheft.
Rullende vedheft, tilrettelagt av selectin-medierte interaksjoner, er en svært dynamisk, passiv motilitet i å rekruttere leukocytter til betennelsesstedet. Dette fenomenet forekommer i postkapillære venuler, hvor blodstrømmen skyver leukocytter i en rullende bevegelse på endotelcellene. Stabil rulling krever en delikat balanse mellom vedheftsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissosiasjon, slik at cellen forblir festet til overflaten mens den ruller i strømningsretningen. I motsetning til andre vedheftsprosesser som forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedheft svært dynamisk når rullecellene beveger seg over tusenvis av mikroner ved titalls mikron per sekund. Følgelig er konvensjonelle mekanobiologimetoder som trekkraftmikroskopi uegnet til å måle de enkelte vedheftshendelsene og de tilknyttede molekylære kreftene på grunn av den korte tidsskalaen og høy følsomhet som kreves. Her beskriver vi vår siste implementering av adhesjonsfotavtrykkanalysen for å avbilde P-selectin: PSGL-1-interaksjoner i rullende vedheft på molekylært nivå. Denne metoden benytter irreversible DNA-baserte spenningsmålere for å produsere en permanent historie med molekylære vedheftshendelser i form av fluorescensspor. Disse sporene kan avbildet på to måter: (1) sy sammen tusenvis av diffraksjonsbegrensede bilder for å produsere et stort synsfelt, noe som muliggjør utvinning av vedheftsfotavtrykk for hver rullende celle over tusenvis av mikroner i lengde, (2) utfører DNA-PAINT for å rekonstruere superoppløselige bilder av fluorescenssporene innenfor et lite synsfelt. I denne studien ble adhesjonsfotavtrykksanalysen brukt til å studere HL-60-celler som rullet på forskjellige skjærspenninger. Ved å gjøre det var vi i stand til å se for oss den romlige fordelingen av P-selectin: PSGL-1-interaksjonen og få innsikt i deres molekylære krefter gjennom fluorescensintensitet. Dermed gir denne metoden grunnlaget for den kvantitative undersøkelsen av de ulike celleoverflateinteraksjonene som er involvert i rullende vedheft på molekylært nivå.
Den rullende vedheftkaskaden beskriver hvordan sirkulerende celler tether til og ruller langs blodkarveggen1. Passiv rulling formidles primært av selectins, en stor klasse av cellulære vedheftsmolekyler (CAMs)1. Under skjærstrømmen av blod danner leukocytter som uttrykker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) svært forbigående bindinger med P-selectin, som kan uttrykkes på overflaten av betente endotelceller. Denne prosessen er kritisk for leukocytter å migrere til et sted med betennelse2. I tillegg er PSGL-1 også en mekanosensitiv reseptor som er i stand til å utløse det påfølgende faste vedheftsstadiet av den rullende vedheftkaskaden ved sitt engasjement med P-selectin3.
Genetiske mutasjoner som påvirker CAM-funksjonen kan ha stor innvirkning på immunforsvaret, for eksempel ved den sjeldne sykdommen leukocyttadhesjonsmangel (LAD), der funksjonsfeil i vedheftmolekyler som formidler rullende fører til alvorlig immunkompromitterte individer4,5,6. I tillegg har sirkulerende tumorceller vist seg å migrere etter en lignende rulleprosess, noe som fører til metastase7,8. Men fordi cellerulling er rask og dynamisk, er konvensjonelle eksperimentelle mekanobiologimetoder uegnet til å studere molekylære interaksjoner under cellerulling. Mens enkeltcellede og enkeltmolekylelle manipulasjonsmetoder som atomkraftmikroskopi og optisk pinsett var i stand til å studere molekylære interaksjoner som P-selectins kraftavhengige interaksjon med PSGL-1 på enkeltmolekylnivå9, er de uegnet til å undersøke levende vedheftshendelser under cellerulling. I tillegg kan interaksjonen karakterisert in vitro ikke svare direkte på spørsmålet om molekylær vedheft in vivo. For eksempel, hvilket molekylært spenningsområde er biologisk relevant når celler fungerer i sitt opprinnelige miljø? Beregningsmetoder som limdynamikksimulering10 eller enkel steady-state model11 har fanget visse molekylære detaljer og hvordan de påvirker rullende oppførsel, men er svært avhengige av nøyaktigheten av modelleringsparametrene og antagelsene. Andre teknikker som trekkraftmikroskopi kan oppdage krefter under cellemigrering, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning eller kvantitativ informasjon om molekylær spenning. Ingen av disse teknikkene kan gi direkte eksperimentelle observasjoner av den tidsmessige dynamikken, romlig fordeling og størrelsen heterogenitet av molekylære krefter, som direkte relaterer seg til cellefunksjon og oppførsel i sitt opprinnelige miljø.
Derfor er implementering av en molekylær kraftsensor som er i stand til nøyaktig måling av selectin-medierte interaksjoner avgjørende for å forbedre vår forståelse av rullende vedheft. Her beskriver vi protokollen for adhesjonsfotavtrykket assay12 der PSGL-1 belagte perler rulles på en overflate som presenterer p-selectin funksjonaliserte spenningsmålerte tthers (TGTs)13. Disse TGTene er irreversible DNA-baserte kraftsensorer som resulterer i en permanent historie med bruddhendelser i form av fluorescensavlesning. Dette oppnås gjennom rupturing av TGT (dsDNA) og deretter etterfølgende merking av ruptured TGT (ssDNA) med en fluorescerende merket komplementær tråd. En stor fordel med dette systemet er kompatibiliteten med både diffraksjonsbegrenset og superoppløsningsavbildning. Den fluorescerende merkede komplementære tråden kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraksjonsbegrenset avbildning eller forbigående bundet (7-9 bp) for bildebehandling med superoppløsning gjennom DNA PAINT. Dette er et ideelt system for å studere rullende vedheft da TGT-ene brister under aktiv rulling, men fluorescensavlesningen analyseres etter rulling. De to avbildningsmetodene gir også brukeren mer frihet til å undersøke rullende vedheft. Vanligvis er diffraksjonsbegrenset avbildning nyttig for å trekke ut molekylær bruddkraft gjennom fluorescensintensitet13, mens superoppløsningsavbildning gir kvantitativ analyse av reseptortetthet. Med evnen til å undersøke disse egenskapene til rullende vedheft, gir denne tilnærmingen en lovende plattform for å forstå kraftreguleringsmekanismen på molekylær vedheft av rullende celler under skjærstrøm.
Adhesjonsfotavtrykksanalysen muliggjør visualisering av molekylære vedheftshendelser mellom PSGL-1 og P-selectin under cellerulling. Denne prosessen er initiert av P-selectin-mediert fangst etterfulgt av rullende under fluidisk skjær stress. Potensielle problemer under eksperimentet innebærer vanligvis dårlig cellerulling eller manglende fluorescerende spor selv når cellene ruller godt. Disse problemene skyldes ofte kvalitetskontroller ved de kritiske trinnene i protokollen, som oppført i feilsøkingstabellen (<st…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) og University of British Columbia Eminence Fund.
4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
GelGreen | Biotium | 41005 | |
Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |