A adesão molecular de imagem em rolamento celular por ensaio de pegada de adesão
Summary
Este protocolo apresenta os procedimentos experimentais para realizar o ensaio da pegada de adesão para a imagem dos eventos de adesão durante a adesão rápida ao rolamento celular.
Abstract
A adesão de rolamento, facilitada por interações seletivas mediadas, é uma motilidade altamente dinâmica e passiva no recrutamento de leucócitos para o local da inflamação. Este fenômeno ocorre em venules pós-capilares, onde o fluxo sanguíneo empurra leucócitos em um movimento de rolamento sobre as células endoteliais. O rolamento estável requer um delicado equilíbrio entre a formação de vínculos de adesão e sua dissociação mecanicamente conduzida, permitindo que a célula permaneça presa à superfície enquanto rola na direção do fluxo. Ao contrário de outros processos de adesão que ocorrem em ambientes relativamente estáticos, a adesão é altamente dinâmica à medida que as células rolante viajam sobre milhares de mícrons a dezenas de mícrons por segundo. Consequentemente, métodos convencionais de mecanobiologia, como microscopia de força de tração, são inadequados para medir os eventos de adesão individual e as forças moleculares associadas devido à curta escala de tempo e alta sensibilidade necessária. Aqui, descrevemos nossa mais recente implementação do ensaio de pegada de adesão para imagem das interações P-selectin: PSGL-1 na adesão de rolamento no nível molecular. Este método utiliza amarras irreversíveis de medidor de tensão baseada em DNA para produzir uma história permanente de eventos de adesão molecular na forma de trilhas de fluorescência. Essas faixas podem ser imagens de duas maneiras: (1) costurando milhares de imagens limitadas à difração para produzir um grande campo de visão, permitindo a extração de pegada de adesão de cada célula rolante sobre milhares de mícrons de comprimento, (2) realizando DNA-PAINT para reconstruir imagens de super-resolução das faixas de fluorescência dentro de um pequeno campo de visão. Neste estudo, o ensaio de pegada de adesão foi utilizado para estudar células HL-60 rolando em diferentes estresses de tesoura. Ao fazê-lo, fomos capazes de imaginar a distribuição espacial da interação P-selectin: PSGL-1 e obter insights sobre suas forças moleculares através da intensidade da fluorescência. Assim, este método fornece as bases para a investigação quantitativa das diversas interações célula-superfície envolvidas na adesão de rolamento a nível molecular.
Introduction
A cascata de aderência rolando descreve como as células circulantes se amarram e rolam ao longo da parede do vaso sanguíneo1. O rolamento passivo é mediado principalmente por selectins, uma grande classe de moléculas de adesão celular (CAMs)1. Sob o fluxo de cisalhamento de sangue, leucócitos expressando ligante de glicoproteína P-selectin -1 (PSGL-1) formam ligações altamente transitórias com p-selectina, que podem ser expressas na superfície de células endoteliais inflamadas. Esse processo é fundamental para que os leucócitos migrem para um local de inflamação2. Além disso, o PSGL-1 também é um receptor mecanosensível capaz de desencadear o estágio subsequente de adesão firme da cascata de adesão rolando após seu engajamento com P-selectin3.
Mutações genéticas que afetam a função CAM podem afetar severamente o sistema imunológico, como na rara doença da deficiência de adesão leucócito (LAD), onde o mau funcionamento das moléculas de adesão que mediam o rolamento leva a indivíduos severamente imunocomprometidos4,5,6. Além disso, as células tumorais circulantes têm sido mostradas para migrar após um processo de rolagem semelhante, levando à metástase7,8. No entanto, como o rolamento celular é rápido e dinâmico, os métodos de mecanobiologia experimental convencionais são inadequados para estudar interações moleculares durante o rolamento celular. Embora métodos de manipulação de células únicas e moléculas únicas, como microscopia de força atômica e pinça óptica, foram capazes de estudar interações moleculares, como a interação dependente da força de P-selectin com o PSGL-1 no nível de molécula única9, eles são inadequados para investigar eventos de adesão ao vivo durante o rolamento celular. Além disso, a interação caracterizada in vitro não pode responder diretamente à pergunta sobre a adesão molecular in vivo. Por exemplo, que faixa de tensão molecular é biologicamente relevante quando as células estão funcionando em seu ambiente nativo? Métodos computacionais, como simulação de dinâmica adesiva10 ou modelo simples de estado estável11, capturaram certos detalhes moleculares e como influenciam o comportamento de rolamento, mas são altamente dependentes da precisão dos parâmetros e suposições de modelagem. Outras técnicas como microscopia de força de tração podem detectar forças durante a migração celular, mas não fornecem resolução espacial suficiente ou informações quantitativas sobre tensão molecular. Nenhuma dessas técnicas pode fornecer observações experimentais diretas da dinâmica temporal, distribuição espacial e heterogeneidade de magnitude das forças moleculares, que se relacionam diretamente com a função celular e o comportamento em seu ambiente nativo.
Portanto, implementar um sensor de força molecular capaz de medir com precisão interações seletivas mediadas é crucial para melhorar nossa compreensão da adesão de rolamento. Aqui, descrevemos o protocolo para o ensaio de pegada de adesão12 onde as contas revestidas psgl-1 são enroladas em uma superfície apresentando amarras de medidor de tensão funcionalizadas p-selectin (TGTs)13. Estes TGTs são sensores de força irreversíveis baseados em DNA que resultam em um histórico permanente de eventos de ruptura na forma de leitura de fluorescência. Isso é conseguido através da ruptura do TGT (dsDNA) e, em seguida, posterior rotulagem do TGT rompido (ssDNA) com uma cadeia complementar fluorescentemente rotulada. Uma grande vantagem deste sistema é sua compatibilidade com imagens limitadas à difração e super-resolução. O fio complementar fluorescente ou rotulado pode ser permanentemente vinculado (>12 bp) para imagens limitadas à difração ou vinculado transitoriamente (7-9 bp) para imagens de super-resolução através de TINTA DE DNA. Este é um sistema ideal para estudar a adesão de rolamento, pois os TGTs são rompidos durante o rolamento ativo, mas a leitura da fluorescência é analisada após a rolagem. Os dois métodos de imagem também proporcionam ao usuário mais liberdade para investigar a adesão em rolamento. Normalmente, a imagem limitada à difração é útil para extrair força de ruptura molecular através da intensidade da fluorescência13, enquanto a imagem de super-resolução permite a análise quantitativa da densidade do receptor. Com a capacidade de investigar essas propriedades de adesão de rolamento, essa abordagem fornece uma plataforma promissora para entender o mecanismo de regulação da força sobre a adesão molecular das células rolantes sob fluxo de cisalhamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
O ensaio de pegada de adesão permite a visualização dos eventos de adesão molecular entre PSGL-1 e P-selectin durante a adesão ao rolamento celular. Este processo é iniciado por captura mediada por P-selectin seguido de rolagem sob estresse fluido de tesoura. Problemas potenciais durante o experimento geralmente envolvem más rolamentos celulares ou rastros fluorescentes ausentes mesmo quando as células rolam bem. Esses problemas muitas vezes são resultantes de controles de qualidade nas etapas críticas do proto…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Inovação do Canadá (CFI 35492), Conselho de Ciências Naturais e Engenharia do Canadá Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) e a University of British Columbia Emin Fund.
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
Referências
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
