接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング
Summary
このプロトコルは、高速細胞圧延接着中に接着イベントを画像化するために、接着フットプリントアッセイを実行するための実験的手順を提示する。
Abstract
転動接着は、選択的に媒介される相互作用によって促進され、炎症部位に白血球を採用する上で非常に動的で受動的な運動性である。この現象は、血流が内皮細胞の転動で白血球を押し出す後毛細血管小胞で起こる。安定した転がりは、接着結合形成と機械的に駆動された解離との微妙なバランスを必要とし、細胞が流れの方向に転がり続けながら表面に付着したままにする。比較的静的な環境で発生する他の接着プロセスとは異なり、転がり細胞は毎秒数十ミクロンで数千ミクロンにわたって移動するので、圧着は非常にダイナミックです。その結果、トラクションフォース顕微鏡などの従来のメカノバイオロジー法は、短いタイムスケールと高感度が要求されるため、個々の接着事象および関連する分子力を測定するのには適していません。ここでは、P-セレクチン:分子レベルでの圧延接着におけるPSGL-1相互作用をイメージする接着フットプリントアッセイの最新の実装について説明します。この方法は、不可逆的なDNAベースの張力計テザーを利用して、蛍光トラックの形態で分子接着事象の永久履歴を生成する。これらのトラックは、(1)大きな視野を生み出すために何千もの回折限画像をつなぎ合わせ、長さ数千ミクロンにわたって各転球細胞の接着フットプリントを抽出し、(2)DNA-PAINTを実行して小さな視野内の蛍光トラックの超解像画像を再構築するという2つの方法で画像化することができます。本研究では、接着フットプリントアッセイを用いて、異なるせん断応力で転がるHL-60細胞を研究した。そうすることで、P-セレクチンの空間分布をイメージすることができました:PSGL-1相互作用と蛍光強度を通じて分子力に関する洞察を得ることができました。このように、この方法は、分子レベルでの圧延接着に関与する種々の細胞表面相互作用の定量的調査のための基礎を提供する。
Introduction
転がり接着カスケードは、循環細胞が血管壁1に沿ってどのようにテザーおよび転がするかを記述する。受動圧延は主に細胞接着分子(CAM)1の主要クラスであるセレクチンによって媒介される。血液のせん断流の下で、P-セレクチン糖タンパクリガンド-1(PSGL-1)を発現する白血球はP-セレクチンとの非常に一過性の結合を形成し、炎症を起こした内皮細胞の表面に発現し得る。このプロセスは、白血球が炎症部位に移行するために重要です2.さらに、PSGL-1はまた、P-selectin3との関与時に転がり接着カスケードのその後の堅接着段階を引き起こすことができるメカノイアセンセプターである。
CAM機能に影響を与える遺伝子変異は、白血球接着欠損症(LAD)の稀な疾患など免疫系に深刻な影響を及ぼし、転がりを媒介する接着分子の機能不全が重度の免疫不全個体4,5,6に至る。さらに、循環腫瘍細胞は、同様の圧延過程に従って移行することが示されており、転移7,8に至る。しかし、細胞の転がりは速く動的であるため、従来の実験的メカノバイオロジー法は、細胞転動時の分子相互作用を研究するのには適していません。原子間力顕微鏡や光ツイーツァーなどの単一細胞および単一分子操作法は、P-selectinのPSGL-1とPSGL-1との力依存相互作用などの分子相互作用を単一分子レベル9で研究することができたが、細胞転動中の生きた接着事象の調査には不向きである。さらに、インビトロで特徴付けられる相互作用は、生体内での分子接着に関する質問に直接答えることができない。例えば、細胞が本来の環境で機能している場合、生物学的に関連する分子張力範囲は何ですか?粘着力学simulation10や単純定常モデル11のような計算方法は、特定の分子の詳細を捉え、それらが転がり行動にどのように影響するか、モデリングパラメータおよび仮定の精度に大きく依存している。牽引力顕微鏡のような他の技術は細胞の移動の間に力を検出することができるが、十分な空間分解能または分子張力に関する定量的な情報を提供しない。これらの技術のいずれも、自生環境における細胞機能と挙動に直接関係する分子力の時間ダイナミクス、空間分布、および大きさの不均一性の直接的な実験的観察を提供することはできません。
そのため、転がり接着性の理解を深める上で、選択イン媒介相互作用を正確に測定できる分子力センサを実装することが重要です。ここでは、PSGL-1被覆ビーズが機能性テンションゲージテザー(TG)13 を提示する表面上に転がされる接着フットプリントassay12のプロトコルについて説明する。これらのTGは、蛍光読み出しの形で破裂事象の永久的な歴史をもたらす不可逆的なDNAベースの力センサーです。これは、TGT(dsDNA)の破裂後、破裂したTGT(ssDNA)を蛍光標識された相補鎖で標識することによって達成されます。このシステムの大きな利点の1つは、回折限と超解像イメージングの両方との互換性です。蛍光標識された相補鎖は、回折限定画像撮影のために永久に結合(>12 bp)、またはDNA PAINTを介した超解像イメージングのために一過性(7-9 bp)結合することができる。これは、TGがアクティブローリング中に破裂する際にローリング接着を研究するのに理想的なシステムですが、蛍光読み出しは転がり後に分析されます。また、2つのイメージング方法は、ローリング接着を調査する自由度をユーザに提供します。典型的には、回折限定画像は蛍光強度13を介して分子破裂力を抽出するのに有用であるが、超解像イメージングは受容体密度の定量的分析を可能にする。このアプローチは、圧延接着のこれらの特性を調査する能力を持ち、せん断流下の転動細胞の分子接着に関する力制御機構を理解するための有望なプラットフォームを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
接着フットプリントアッセイにより、細胞圧延接着中のPSGL-1とP-セレクチン間の分子接着事象の可視化が可能になります。このプロセスは、P-selectin媒介捕捉によって開始され、その後、流体せん断応力下での転がりが続きます。実験中の潜在的な問題は、通常、細胞がうまく転がっていても、細胞の転がりが悪かったり、蛍光トラックが欠落したりする。これらの問題は、多くの場合、プロ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、カナダイノベーション財団(CFI 35492)、カナダディスカバリーグラント自然科学工学研究評議会(RGPIN-2017-04407)、研究基金のニューフロンティア(NFRFE-2018-00969)、マイケル・スミス健康研究財団(SCH-2020-0559)、ブリティッシュコロンビア大学エミンズ基金によって支援されました。
Materials
| 4-channel drill guide | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| 4-holes slide | Custom made | Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp. | |
| Acetone | VWR | BDH1101-4LP | |
| Acrylic spacer | Custom made | Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder. | |
| Aluminium chip holder | Custom made | Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread. | |
| Aminosilane | AlfaAesar | L14043 | CAS 1760-24-3 |
| Antibiotic/antimycotic solution | Cytiva HyClone | SV3007901 | Pen/Strep/Fungiezone |
| Beads, ProtG coated polystyrene | Spherotech | PGP-60-5 | |
| Bovine serum albumin | VWR | 332 | |
| Buffer, DNA PAINT | 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA | ||
| Buffer, T50M5 | 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 | ||
| Buffer, Rolling | HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA | ||
| Buffer, Wash | 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20 | ||
| Calcium chloride | VWR | BDH9224 | |
| Cell culture flasks | VWR | 10062-868 | |
| Concentrated sulfuric acid | VWR | BDH3072-2.5LG | 95-98% |
| Coverslip holding tweezers | Techni-Tool | 758TW150 | |
| Diamond-coated drill bits | Abrasive technology | C5250510 | 0.75 mm diamond drill |
| DNA, amine-ssDNA (top strand) | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/ |
| DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) | IDT DNA | Custom oligo | /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG |
| DNA, imager strand for DNA-PAINT | IDT DNA | Custom oligo | GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/ |
| DNA, imager strand for permanent labelling | IDT DNA | Custom oligo | CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/ |
| Double-sided tape | Scotch | 237 | 3/4 inch width, permanent double-sided tape |
| EDTA | Thermofisher | 15575020 | 0.5 M EDTA, pH 8.0 |
| Epoxy | Gorilla | 42001 | 5 minute curing time |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Avantor | 97068-085 | |
| GelGreen | Biotium | 41005 | |
| Glacial acetic acid | VWR | BDH3094-2.5LG | |
| Glass, Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| Glass, Microscope slide | VWR | 48300-026 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Glass, Staining jar | VWR | 74830-150 | Wheaton Staining Jar (900620) |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) | Lonza | 04-315Q | |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| Humidity chamber slide support | Custom made | 3D printed with ABS filament | |
| Hydrogen peroxide | VWR | BDH7690-1 | 30% |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| Inlets/outlets | Custom made | Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew | |
| Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) | Lonza | 12-722F | |
| Magnesium chloride | VWR | BDH9244 | |
| Magnetic Ni-NTA beads | Invitrogen | 10103D | |
| Mailer tubes | EMS | EMS71406-10 | |
| Methanol | VWR | BDH1135-4LP | |
| Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns | Biorad | 7326200 | In SSC Buffer |
| PEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000 | |
| PEG-biotin | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Potassium hydroxide | VWR | 470302-132 | |
| Protein, Protein G | Abcam | ab155724 | N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine |
| Protein, P-selectin-Fc | R&D System | 137-PS | Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF |
| Protein, Streptavidin | Cedarlane | CL1005-01-5MG | |
| Pump Syringe | Harvard Apparatus | 704801 | |
| Sodium bicarbonate | Ward’s Science | 470302-444 | |
| Sodium chloride | VWR | 97061-274 | |
| Sulfo-SMCC | Thermofisher | 22322 | |
| Syringe | Hamilton | 81520 | Syringes with PTFE luer lock, 5 mL |
| Syringe needles | BD | 305115 | Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris | VWR | BDH4502-500GP | |
| Tubing, Adaptor | Tygon | ABW00001 | Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32” |
| Tubing, Polyethylene | BD Intramedic | 427406 | Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 |
Referências
- McEver, R. P., Zhu, C. Rolling cell adhesion. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).
- Etzioni, A. Adhesion molecules – Their role in health and disease. Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).
- van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Leukocyte adhesion deficiencies. Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).
- Hanna, S., Etzioni, A. Leukocyte adhesion deficiencies. Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).
- Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation. Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).
- Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis. Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).
- Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules. Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).
- Hammer, D. A. Adhesive dynamics. Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006 (2014).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution. Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).
- Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting. Scientific Reports. 7 (1), 44502 (2017).
- Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting. Science Advances. 7 (34), (2021).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).
- Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica. Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).
- Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549 (2014).
- Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).
- Chalfoun, J., et al. MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization. Scientific Reports. 7 (1), 4988 (2017).
- Wang, X., et al. Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors. Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).
- Crockett-Torabi, E. Selectins and mechanisms of signal transduction. Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).
- Ye, Z., et al. The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway. Cell Death and Disease. 10 (7), 507 (2019).
- Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device. Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).
- Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular forces with serially connected force sensors. Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).
- Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Physical Biology. 17 (1), 011001 (2020).
