Bildemolekylær vedheft i cellerulling ved adhesjonsfotavtrykkanalyse

Summary

Denne protokollen presenterer eksperimentelle prosedyrer for å utføre vedheft fotavtrykk analysen for å avbilde vedheft hendelser under rask celle rullende vedheft.

Abstract

Rullende vedheft, tilrettelagt av selectin-medierte interaksjoner, er en svært dynamisk, passiv motilitet i å rekruttere leukocytter til betennelsesstedet. Dette fenomenet forekommer i postkapillære venuler, hvor blodstrømmen skyver leukocytter i en rullende bevegelse på endotelcellene. Stabil rulling krever en delikat balanse mellom vedheftsbindingsdannelse og deres mekanisk drevne dissosiasjon, slik at cellen forblir festet til overflaten mens den ruller i strømningsretningen. I motsetning til andre vedheftsprosesser som forekommer i relativt statiske miljøer, er rullende vedheft svært dynamisk når rullecellene beveger seg over tusenvis av mikroner ved titalls mikron per sekund. Følgelig er konvensjonelle mekanobiologimetoder som trekkraftmikroskopi uegnet til å måle de enkelte vedheftshendelsene og de tilknyttede molekylære kreftene på grunn av den korte tidsskalaen og høy følsomhet som kreves. Her beskriver vi vår siste implementering av adhesjonsfotavtrykkanalysen for å avbilde P-selectin: PSGL-1-interaksjoner i rullende vedheft på molekylært nivå. Denne metoden benytter irreversible DNA-baserte spenningsmålere for å produsere en permanent historie med molekylære vedheftshendelser i form av fluorescensspor. Disse sporene kan avbildet på to måter: (1) sy sammen tusenvis av diffraksjonsbegrensede bilder for å produsere et stort synsfelt, noe som muliggjør utvinning av vedheftsfotavtrykk for hver rullende celle over tusenvis av mikroner i lengde, (2) utfører DNA-PAINT for å rekonstruere superoppløselige bilder av fluorescenssporene innenfor et lite synsfelt. I denne studien ble adhesjonsfotavtrykksanalysen brukt til å studere HL-60-celler som rullet på forskjellige skjærspenninger. Ved å gjøre det var vi i stand til å se for oss den romlige fordelingen av P-selectin: PSGL-1-interaksjonen og få innsikt i deres molekylære krefter gjennom fluorescensintensitet. Dermed gir denne metoden grunnlaget for den kvantitative undersøkelsen av de ulike celleoverflateinteraksjonene som er involvert i rullende vedheft på molekylært nivå.

Introduction

Den rullende vedheftkaskaden beskriver hvordan sirkulerende celler tether til og ruller langs ^{blodkarveggen1}. Passiv rulling formidles primært av selectins, en stor klasse av cellulære vedheftsmolekyler (CAMs)¹. Under skjærstrømmen av blod danner leukocytter som uttrykker P-selectin glykoprotein ligand-1 (PSGL-1) svært forbigående bindinger med P-selectin, som kan uttrykkes på overflaten av betente endotelceller. Denne prosessen er kritisk for leukocytter å migrere til et sted med ^betennelse2. I tillegg er PSGL-1 også en mekanosensitiv reseptor som er i stand til å utløse det påfølgende faste vedheftsstadiet av den rullende vedheftkaskaden ved sitt engasjement med P-selectin3.

Genetiske mutasjoner som påvirker CAM-funksjonen kan ha stor innvirkning på immunforsvaret, for eksempel ved den sjeldne sykdommen leukocyttadhesjonsmangel (LAD), der funksjonsfeil i vedheftmolekyler som formidler rullende fører til alvorlig immunkompromitterte ^{individer4,5,6}. I tillegg har sirkulerende tumorceller vist seg å migrere etter en lignende rulleprosess, noe som fører til ^metastase7,8. Men fordi cellerulling er rask og dynamisk, er konvensjonelle eksperimentelle mekanobiologimetoder uegnet til å studere molekylære interaksjoner under cellerulling. Mens enkeltcellede og enkeltmolekylelle manipulasjonsmetoder som atomkraftmikroskopi og optisk pinsett var i stand til å studere molekylære interaksjoner som P-selectins kraftavhengige interaksjon med PSGL-1 på enkeltmolekylnivå9, er de uegnet til å undersøke levende vedheftshendelser under cellerulling. I tillegg kan interaksjonen karakterisert in vitro ikke svare direkte på spørsmålet om molekylær vedheft in vivo. For eksempel, hvilket molekylært spenningsområde er biologisk relevant når celler fungerer i sitt opprinnelige miljø? Beregningsmetoder som ^{limdynamikksimulering10} eller enkel steady-state ^model11 har fanget visse molekylære detaljer og hvordan de påvirker rullende oppførsel, men er svært avhengige av nøyaktigheten av modelleringsparametrene og antagelsene. Andre teknikker som trekkraftmikroskopi kan oppdage krefter under cellemigrering, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning eller kvantitativ informasjon om molekylær spenning. Ingen av disse teknikkene kan gi direkte eksperimentelle observasjoner av den tidsmessige dynamikken, romlig fordeling og størrelsen heterogenitet av molekylære krefter, som direkte relaterer seg til cellefunksjon og oppførsel i sitt opprinnelige miljø.

Derfor er implementering av en molekylær kraftsensor som er i stand til nøyaktig måling av selectin-medierte interaksjoner avgjørende for å forbedre vår forståelse av rullende vedheft. Her beskriver vi protokollen for adhesjonsfotavtrykket ^assay12 der PSGL-1 belagte perler rulles på en overflate som presenterer p-selectin funksjonaliserte spenningsmålerte tthers (TGTs)¹³. Disse TGTene er irreversible DNA-baserte kraftsensorer som resulterer i en permanent historie med bruddhendelser i form av fluorescensavlesning. Dette oppnås gjennom rupturing av TGT (dsDNA) og deretter etterfølgende merking av ruptured TGT (ssDNA) med en fluorescerende merket komplementær tråd. En stor fordel med dette systemet er kompatibiliteten med både diffraksjonsbegrenset og superoppløsningsavbildning. Den fluorescerende merkede komplementære tråden kan enten være permanent bundet (>12 bp) for diffraksjonsbegrenset avbildning eller forbigående bundet (7-9 bp) for bildebehandling med superoppløsning gjennom DNA PAINT. Dette er et ideelt system for å studere rullende vedheft da TGT-ene brister under aktiv rulling, men fluorescensavlesningen analyseres etter rulling. De to avbildningsmetodene gir også brukeren mer frihet til å undersøke rullende vedheft. Vanligvis er diffraksjonsbegrenset avbildning nyttig for å trekke ut molekylær bruddkraft gjennom fluorescensintensitet13, mens superoppløsningsavbildning gir kvantitativ analyse av reseptortetthet. Med evnen til å undersøke disse egenskapene til rullende vedheft, gir denne tilnærmingen en lovende plattform for å forstå kraftreguleringsmekanismen på molekylær vedheft av rullende celler under skjærstrøm.

Protocol

1. Oligonukleotid merking og hybridisering Reduksjon av protein G disulfidbindinger Løs opp 10 mg Protein G (ProtG) i 1 ml ultrarent vann.MERK: Protein G her er modifisert med en enkelt cysteinrester ved C-terminus og en N-terminus poly-histidin tag. Bufferutveksling ≥20 μL ProtG (10 mg/ml) til 1x PBS (pH 7,2) med en P6-kolonne. Mål proteinkonsentrasjonen etter bufferutveksling.MERK: Typisk konsentrasjon på 7-8 mg/ml. Forbered 120 mM Tris(2…

Representative Results

Protokollen ovenfor beskriver den eksperimentelle prosedyren for adhesjonsfotavtrykkanalysen. Den generelle eksperimentarbeidsflyten er illustrert i figur 1, fra strømningskammerenheten (figur 1A) til overflatefunksjonaliseringen (figur 1B) og eksperiment- og bildetrinn (figur 1C). Figur 2 er et representativt resultat for protG-ssDNA biokonjuge…

Discussion

Adhesjonsfotavtrykksanalysen muliggjør visualisering av molekylære vedheftshendelser mellom PSGL-1 og P-selectin under cellerulling. Denne prosessen er initiert av P-selectin-mediert fangst etterfulgt av rullende under fluidisk skjær stress. Potensielle problemer under eksperimentet innebærer vanligvis dårlig cellerulling eller manglende fluorescerende spor selv når cellene ruller godt. Disse problemene skyldes ofte kvalitetskontroller ved de kritiske trinnene i protokollen, som oppført i feilsøkingstabellen (<st…

Materials

4-channel drill guide	Custom made		3D printed with ABS filament
4-holes slide	Custom made		Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone	VWR	BDH1101-4LP
Acrylic spacer	Custom made		Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder	Custom made		Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane	AlfaAesar	L14043	CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution	Cytiva HyClone	SV3007901	Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene	Spherotech	PGP-60-5
Bovine serum albumin	VWR	332
Buffer, DNA PAINT			0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5			10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling			HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash			10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride	VWR	BDH9224
Cell culture flasks	VWR	10062-868
Concentrated sulfuric acid	VWR	BDH3072-2.5LG	95-98%
Coverslip holding tweezers	Techni-Tool	758TW150
Diamond-coated drill bits	Abrasive technology	C5250510	0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand)	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand)	IDT DNA	Custom oligo	/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT	IDT DNA	Custom oligo	GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling	IDT DNA	Custom oligo	CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape	Scotch	237	3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA	Thermofisher	15575020	0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy	Gorilla	42001	5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	97068-085
GelGreen	Biotium	41005
Glacial acetic acid	VWR	BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips	Fisher Scientific	12-548-5P
Glass, Microscope slide	VWR	48300-026	75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar	VWR	74830-150	Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS)	Lonza	04-315Q
Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629-1EA
HL-60 cells	ATCC	CCL-240
Humidity chamber slide support	Custom made		3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide	VWR	BDH7690-1	30%
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Inlets/outlets	Custom made		Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	Lonza	12-722F
Magnesium chloride	VWR	BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads	Invitrogen	10103D
Mailer tubes	EMS	EMS71406-10
Methanol	VWR	BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns	Biorad	7326200	In SSC Buffer
PEG	Laysan Bio	MPEG-SVA-5000
PEG-biotin	Laysan Bio	Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide	VWR	470302-132
Protein, Protein G	Abcam	ab155724	N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc	R&D System	137-PS	Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin	Cedarlane	CL1005-01-5MG
Pump Syringe	Harvard Apparatus	704801
Sodium bicarbonate	Ward’s Science	470302-444
Sodium chloride	VWR	97061-274
Sulfo-SMCC	Thermofisher	22322
Syringe	Hamilton	81520	Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles	BD	305115	Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP	Sigma-Aldrich	C4706-2G
Tris	VWR	BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor	Tygon	ABW00001	Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene	BD Intramedic	427406	Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20	Sigma-Aldrich	93773