Erzeugung von Transgenics und Knockouts in Strongyloides-Spezies durch Mikroinjektion

Summary

Das funktionelle genomische Toolkit für die parasitären Nematoden Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti umfasst Transgenese, CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese und RNAi. Dieses Protokoll wird zeigen, wie intragonadale Mikroinjektion verwendet werden kann, um Transgene und CRISPR-Komponenten in S. stercoralis und S. ratti einzuführen.

Abstract

Die Gattung Strongyloides besteht aus mehreren Arten von hautdurchdringenden Nematoden mit unterschiedlichen Wirtsbereichen, darunter Strongyloides stercoralis und Strongyloides ratti. S. stercoralis ist ein menschlich-parasitärer, hautdurchdringender Nematod, der etwa 610 Millionen Menschen infiziert, während der Rattenparasit S. ratti eng mit S. stercoralis verwandt ist und oft als Labormodell für S. stercoralis verwendet wird. Sowohl S. stercoralis als auch S. ratti sind leicht für die Erzeugung von Transgenen und Knockouts durch die exogene Nukleinsäure-Abgabetechnik der intragonadalen Mikroinjektion zugänglich und haben sich als solche als Modellsysteme für andere parasitäre Helminthen herausgestellt, die dieser Technik noch nicht zugänglich sind.

Parasitäre Strongyloides-Erwachsene bewohnen den Dünndarm ihres Wirtes und setzen Nachkommen über den Kot in die Umwelt frei. Einmal in der Umwelt, entwickeln sich die Larven zu frei lebenden Erwachsenen, die im Kot leben und Nachkommen produzieren, die einen neuen Wirt finden und eindringen müssen. Diese Umweltgeneration ist einzigartig für die Strongyloides-Arten und ähnelt in der Morphologie so sehr der modellhaft freilebenden Nematode Caenorhabditis elegans, dass Techniken, die für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit diesen parasitären Nematoden, einschließlich intragonadaler Mikroinjektion, angepasst werden können. Mit Hilfe der intragonadalen Mikroinjektion kann eine Vielzahl von Transgenen in Strongyloides eingeführt werden. CRISPR/Cas9-Komponenten können auch mikroinjiziert werden, um mutierte Strongyloides-Larven zu erzeugen. Hier wird die Technik der intragonadalen Mikroinjektion in Strongyloide , einschließlich der Vorbereitung freilebender Erwachsener, des Injektionsverfahrens und der Selektion transgener Nachkommen, beschrieben. Bilder von transgenen Strongyloides-Larven , die mit CRISPR/Cas9-Mutagenese erstellt wurden, sind enthalten. Ziel dieser Arbeit ist es, anderen Forschern die Möglichkeit zu geben, mit Hilfe der Mikroinjektion transgene und mutierte Strongyloide herzustellen.

Introduction

Strongyloides stercoralis wurde lange Zeit als wichtiger menschlicher Krankheitserreger im Vergleich zu den weiter verbreiteten Hakenwürmern und dem Spulwurm Ascaris lumbricoides¹ übersehen. Frühere Studien zur Wurmbelastung unterschätzten die Prävalenz von S. stercoralis aufgrund der geringen Sensitivität gängiger Diagnosemethoden für S. stercoralis^oft stark 2. In den letzten Jahren haben epidemiologische Studien, die auf verbesserten diagnostischen Instrumenten basieren, geschätzt, dass die tatsächliche Prävalenz von S. stercoralis-Infektionen viel höher ist als zuvor berichtet, etwa 610 Millionen Menschen weltweit².

Sowohl S. stercoralis als auch andere Strongyloides-Arten, einschließlich des eng verwandten Rattenparasiten und des gemeinsamen Labormodells S. ratti, haben einen ungewöhnlichen Lebenszyklus, der für experimentelle genomische Studien von Vorteil ist, da er sowohl aus parasitären als auch aus freilebenden (Umwelt-) Generationen 3 besteht (Abbildung 1^). Insbesondere können sowohl S. stercoralis als auch S. ratti durch eine einzige frei lebende Generation durchlaufen. Die freilebende Generation besteht aus postparasitären Larven, die sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen und Weibchen entwickeln; Alle Nachkommen der frei lebenden Erwachsenen entwickeln sich zu infektiösen Larven, die einen Wirt infizieren müssen, um den Lebenszyklus fortzusetzen. Darüber hinaus kann diese ökologische oder frei lebende Generation im Labor experimentell manipuliert werden. Da freilebende Strongyloides-Erwachsene und C. elegans-Erwachsene eine ähnliche Morphologie aufweisen, können Techniken wie die intragonadale Mikroinjektion, die ursprünglich für C. elegans entwickelt wurden, für die Verwendung mit freilebenden erwachsenen Strongyloides ^4,5 angepasst werden. Während DNA im Allgemeinen in frei lebende erwachsene Weibchen eingeführt wird, können sowohl Männer als auch Frauen von Strongyloides mikroinjiziert werden⁶. Somit stehen funktionelle genomische Werkzeuge zur Verfügung, um viele Aspekte der Biologie von Strongyloides zu untersuchen. Anderen parasitären Nematoden fehlt eine frei lebende Generation und sie sind daher nicht so leicht für funktionelle genomische Techniken^{geeignet 3}.

Abbildung 1: Der Lebenszyklus von Strongyloides stercoralis. Die parasitären Weibchen von S. stercoralis bewohnen den Dünndarm ihrer Säugetierwirte (Menschen, nichtmenschliche Primaten, Hunde). Die parasitären Weibchen vermehren sich durch Parthenogenese und legen Eier in den Dünndarm. Die Eier schlüpfen, während sie sich noch im Inneren des Wirts befinden, zu postparasitären Larven, die dann mit Kot in die Umwelt gelangen. Wenn die postparasitären Larven männlich sind, entwickeln sie sich zu frei lebenden erwachsenen Männchen. Wenn die postparasitären Larven weiblich sind, können sie sich entweder zu frei lebenden erwachsenen Weibchen (indirekte Entwicklung) oder zu infektiösen Larven im dritten Stadium (iL3s; direkte Entwicklung) entwickeln. Die frei lebenden Männchen und Weibchen vermehren sich sexuell, um Nachkommen zu schaffen, die gezwungen sind, iL3s zu werden. Unter bestimmten Bedingungen kann S. stercoralis auch einer Autoinfektion unterzogen werden, bei der einige der postparasitären Larven im Darm des Wirts verbleiben, anstatt im Kot in die Umwelt überzugehen. Diese Larven können sich im Inneren des Wirts zu autoinfektiösen Larven (L3a) entwickeln, durch die Darmwand eindringen, durch den Körper wandern und schließlich in den Darm zurückkehren, um reproduktive Erwachsene zu werden. Der Lebenszyklus von S. ratti ist ähnlich, außer dass S. ratti Ratten infiziert und keinen autoinfektiösen Zyklus hat. Die Umweltgenerierung ist der Schlüssel zur Verwendung von Strongyloides-Arten für genetische Studien. Die frei lebenden erwachsenen Weibchen (P₀) können mikroinjiziert werden; ihre Nachkommen, die alle zu iL3s werden, sind die potenziellen F 1-Transgenen. Diese Figur wurde von Castelletto et al. modifiziert. ³. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

S. stercoralis teilt viele Aspekte seiner Biologie mit anderen gastrointestinalen menschlich-parasitären Nematoden, einschließlich Wirtsinvasion und Wirtsimmunmodulation. Zum Beispiel infizieren sich auch humanparasitäre Hakenwürmer der Gattungen Necator und Ancylostoma durch Hautpenetration, navigieren ähnlich durch den Körper und leben schließlich als parasitäre Erwachsene im^{Dünndarm 7}. Daher verwenden viele gastrointestinale Nematoden wahrscheinlich gängige sensorische Verhaltensweisen und Immunevasionstechniken. Infolgedessen wird das aus Strongyloides gewonnene Wissen die Ergebnisse anderer weniger genetisch beherrschbarer Nematoden ergänzen und zu einem vollständigeren Verständnis dieser komplexen und wichtigen Parasiten führen.

Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methode zur Einführung von DNA in Strongyloides freilebende erwachsene Frauen, um transgene und mutierte Nachkommen herzustellen. Die Anforderungen an die Aufrechterhaltung des Stammes, einschließlich des Entwicklungszeitpunkts von erwachsenen Würmern für Mikroinjektionen und der Sammlung transgener Nachkommen, werden beschrieben. Protokolle und eine Demonstration der vollständigen Mikroinjektionstechnik sowie Protokolle für die Kultivierung und das Screening transgener Nachkommen sind enthalten, zusammen mit einer Liste aller notwendigen Geräte und Verbrauchsmaterialien.

Protocol

HINWEIS: Rennmäuse wurden an die Passage S. stercoralis und die Ratten an die Passage S. ratti gewöhnt. Alle Verfahren wurden vom UCLA Office of Animal Research Oversight (Protokoll Nr. 2011-060-21A) genehmigt, das sich an die AAALAC-Standards und den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren hält. Die folgenden Aufgaben müssen mindestens einen Tag vor der Mikroinjektion abgeschlossen werden: Wurmkultivierung, Vorbereitung von Mikroinjektionspads, Erstellen von Konstrukten für die Mi…

Representative Results

Wenn das Experiment erfolgreich war, exprimieren die F 1-Larven den Transgen- und/oder Mutantenphänotyp von Interesse (Abbildung 4). Die Transformationsraten sind jedoch sehr unterschiedlich und hängen von den Konstrukten, der Gesundheit der Würmer, den Kultivierungsbedingungen nach der Injektion und den Fähigkeiten des Experimentators ab. Im Allgemeinen ergibt ein erfolgreiches Experiment >15 F1-Larven pro injizierter Frau und eine Transformationsrate von >3% für …

Discussion

Dieses Mikroinjektionsprotokoll beschreibt die Methoden zur Einführung von Konstrukten für Transgenese und CRISPR/Cas9-vermittelte Mutagenese in S. stercoralis und S . ratti. Sowohl für S. stercoralis als auch für S. ratti unterliegen das Überleben nach der Injektion und die Transgenese- oder Mutageneserate mehreren Variablen, die fein abgestimmt werden können.

Die erste kritische Überlegung für eine erfolgreiche Transgenese ist, wie Plasmidtransgen…

Materials

(−)-Nicotine, ≥99% (GC), liquid	Sigma-Aldrich	N3876-5ML	nicotine for paralyzing worms
3" iron C-clamp, 3" x 2" (capacity x depth)	VWR	470121-790	C-clamp to secure setup to bench top
Agarose LE	Phenix	RBA-500	agarose for slides
Bone char, 4 lb pail, 10 x 28 mesh	Ebonex	n/a	charcoal for fecal-charcoal cultures
Bone char, granules, 10 x 28 mesh	Reade	bonechar10x28	charcoal for fecal-cultures (alternative to the above)
Coarse micromanipulator	Narishige	MMN-1	coarse micromanipulator
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters	Fisher	07-200-385	microfilter column
Cover glass, 48 x 60 mm, No. 1 thickness	Brain Research Lab	4860-1	coverslips (48 x 60 mm)
Deep Petri dishes, heavy version with 6 vents, 100 mm diameter	VWR	82050-918	10 cm Petri dishes (for fecal-charcoal cultures)
Eisco retort base w/ rod	Fisher	12-000-101	stand for Baermann apparatus
Eppendorf FemtoJet microinjector microloader tips	VWR	89009-310	for filling microinjection needles
Fisherbrand absorbent underpads	Fisher	14-206-62	bench paper (for prepping)
Fisherbrand Cast-Iron Rings	Fisher	14-050CQ	Baermann o-ring
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for mixing)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (for catch bucket/water bucket)
Fisherbrand tri-cornered polypropylene beakers	Fisher	14-955-111F	Plastic beaker (x2) (to make holder)
Gorilla epoxie in syringe	McMaster-Carr	7541A51	glue (to attach tubing)
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-50ML	halocarbon oil
High-temperature silicone rubber tubing for food and beverage, 1/2" ID, 5/8" OD	McMaster-Carr	3038K24	tubing (for funnel)
KIMAX funnels, long stem, 60° Angle, Kimble Chase	VWR	89001-414	Baermann funnel
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science benchtop protectors	Fisher	15-235-101	bench paper (for prepping)
Leica stereomicroscope with fluorescence	Leica	M165 FC	GFP stereomicroscope for identifying and sorting transgenic worms
microINJECTOR brass straight arm needle-holder	Tritech	MINJ-4	microinjection needle holder
microINJECTOR system	Tritech	MINJ-1	microinjection system
Mongolian Gerbils	Charles River Laboratories	213-Mongolian Gerbil	gerbils for maintenance of S. stercoralis, male 4-6 weeks
Nasco Whirl-Pak easy-to-close bags, 18 oz	VWR	11216-776	Whirl-Pak sample bags
Nylon tulle (mesh)	Jo-Ann Fabrics	zprd_14061949a	nylon mesh for Baermann holder
Platinum wire, 36 Gauge, per inch	Thomas Scientific	1233S72	platinum/iridium wire for worm picks
Puritan tongue depressors, 152 mm (L) x 17.5 mm (W)	VWR	62505-007	wood sticks (for mixing samples)
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)	QIAGEN	27106	QIAGEN miniprep kit
Rats-Long Evans	Envigo	140 HsdBlu:LE Long Evans	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Rats-Sprague Dawley	Envigo	002 Hsd:Sprague Dawley SD	rats for maintenance of S. ratti, female 4-6 weeks
Really Useful Boxes translucent storage boxes with lids, 1.6 L capacity, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16"	Office Depot	452369	plastic boxes for humidified chamber
Shepherd techboard, 8 x 16.5 inches	Newco	999589	techboard
Stainless steel raised wire floor	Ancare	R20SSRWF	wire cage bottoms
StalkMarket compostable cutlery spoons, 6", white, pack of 1,000	Office Depot	9587303	spoons
Stender dish, stacking type, 37 x 25 mm	Carolina (Science)	741012	watch glasses (small, round)
Stereomicroscope	Motic	K-400 LED	dissecting prep scope
Storage tote, color clear/white, outside height 4-7/8 in, outside length 13-5/8 in, Sterilite	Grainger	53GN16	plastic boxes for humidified chamber
Sutter P-30 micropipette puller	Sutter	P-30/P	needle puller with platinum/iridium filament
Syracuse watch glasses	Fisher	S34826	watch glasses (large, round)
Thermo Scientific Castaloy fixed-angle clamps	Fisher	05-769-2Q	funnel clamps (2x)
Three-axis hanging joystick oil hydrolic micromanipulator	Narishige	MM0-4	fine micromanipulator
United Mohr pinchcock clamps	Fisher	S99422	Pinch clamps (2x)
Vented, sharp-edge Petri dishes (60 mm diameter)	Tritech Research	T3308P	6 cm Petri dishes (for small-scale fecal-charcoal cultures)
VWR light-duty tissue wipers	VWR	82003-820	lining for Baermann holder
watch glass, square, 1-5/8 in	Carolina (Science)	742300	watch glasses (small, square)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 5.5 cm diameter	Fisher	09-805B	filter paper (for 6 cm Petri dishes)
Whatman qualitative grade plain circles, grade 1, 9 cm diameter	Fisher	09-805D	filter paper (for 10 cm Petri dishes)
World Precision Instrument borosilicate glass capillary, 1.2 mm x 4 in	Fisher	50-821-813	glass capillaries for microinjection needles
X-Acto Knives, No. 1 Knife With No. 11 Blade	Office Depot	238816	X-Acto knives without blades to hold worm picks
Zeiss AxioObserver A1	Zeiss	n/a	inverted microscope