Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde evaluatie van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte signaleringsremmers in NSCLC-patiënt-afgeleide organoïdemodellen.
Nieuwe 3D-kankerorganoïde culturen afgeleid van klinische patiëntmonsters vormen een belangrijk modelsysteem om intratumor heterogeniteit en behandelingsrespons op gerichte remmers bij kanker te evalueren. Baanbrekend werk in gastro-intestinale en pancreaskankers heeft de belofte van patiënt-afgeleide organoïden (BOB’s) benadrukt als een patiënt-proximaat kweeksysteem, met een toenemend aantal modellen in opkomst. Evenzo heeft het werk bij andere soorten kanker zich gericht op het opzetten van organoïde modellen en het optimaliseren van cultuurprotocollen. Met name 3D-kankerorganoïdemodellen behouden de genetische complexiteit van originele tumormonsters en vertalen zo tumor-afgeleide sequencinggegevens in behandeling met genetisch geïnformeerde gerichte therapieën in een experimentele setting. Verder kunnen BOB’s de evaluatie van rationele combinatiebehandelingen bevorderen om resistentie-geassocieerde aanpassing van tumoren in de toekomst te overwinnen. De laatste richt zich op intense onderzoeksinspanningen bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC), omdat resistentieontwikkeling uiteindelijk het behandelingssucces van gerichte remmers beperkt. Een vroege beoordeling van therapeutisch targetbare mechanismen met behulp van NSCLC-BOB’s zou kunnen helpen bij het informeren van rationele combinatiebehandelingen. Dit manuscript beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor de celkweekplaatgebaseerde beoordeling van geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte remmers in NSCLC-afgeleide 3D-BOB’s, met potentieel aanpassingsvermogen aan combinatiebehandelingen en andere behandelingsmodaliteiten.
Gepersonaliseerde therapieën tegen oncogene factoren hebben een revolutie teweeggebracht in de behandeling van kanker, waardoor de overleving van de patiënt is verbeterd en de door de behandeling gemedieerde bijwerkingen zijn verminderd1. Recente ontwikkelingen in moleculaire diagnostiek en sequencingtechnologieën hebben de complexiteit van menselijke tumoren benadrukt, met ruimtelijke en temporele heterogeniteit die van invloed is op de behandelingsrespons2. Het samenvatten van deze subklonale verschillen in celkweekmodellen is lange tijd beperkt gebleven tot het onderzoeken van geselecteerde veranderingen van belang in anders uniforme cellijnen. Nieuw ontwikkelde 3D PDO-modellen gegenereerd uit tumorbiopten of chirurgische tumorresecties zorgen voor een verbeterde weergave van cellulaire complexiteit en signaaloverspraak in van de patiënt afgeleid tumorweefsel3. Als zodanig zijn tumororganoïden afgeleid van gastro-intestinale en alvleesklierkanker met succes gegenereerd en recapituleren ze de genetische diversiteit en determinanten van de behandelingsrespons4,5,6. Bij niet-kleincellige longkanker (NSCLC) worden organoïde ontwikkelings- en vestigingsuitdagingen erkend en is optimalisatie van kweektechnieken en selectieve mediafactoren nodig om in de toekomst een breder en systematischer gebruik van NSCLC-PDO’s mogelijk te maken7,8.
Het ontwikkelen van combinatorische therapieën gericht op resterende tumorcellen die bestand zijn tegen de initiële medicamenteuze behandeling is essentieel om de ontwikkeling van resistentie te remmen en uiteindelijk de overleving van de patiënt te verbeteren9. Gezien de architecturale complexiteit van organoïde culturen, moeten klassieke geneesmiddelresponsparameters worden geoptimaliseerd om nauwkeurige en reproduceerbare tests van geneesmiddelgevoeligheden mogelijk te maken. Imaging-gebaseerde uitlezingen10,11 en klassieke cel levensvatbaarheidstests die cellulaire ATP-abundantie meten6,12, naast andere technieken, zijn beschikbaar om geneesmiddelresponsen in BOB-culturen te profileren. Hier ontwikkelen en beschrijven we een gestandaardiseerd protocol om geneesmiddelgevoeligheden voor gerichte therapie te evalueren tegen bekende klinische drivers in NSCLC PDO-modellen.
Dit manuscript ontwikkelt en beschrijft een gestandaardiseerd protocol voor het beoordelen van medicijngevoeligheid in NSCLC-afgeleide 3D PDO-modellen. Naast geneesmiddelengevoeligheidsstudies is verdere karakterisering van beschikbare organoïdemodellen nodig om de onderliggende oorzaken voor verschillen in geneesmiddelgevoeligheid te bepalen. Dit kan genetische profilering van organoïden en patiëntmonsters en andere beschikbare analyses voor organoïden omvatten, zoals immunohistochemische kleuring voor differentiatiemarkers en algemene cellulaire signaleringsbiomarkers en fysiologie13,29.
Kritieke stappen in het protocol
Het protocol dat hierin wordt beschreven, biedt een gestandaardiseerde workflow die nauwkeurige en reproduceerbare analyse van de gevoeligheid van geneesmiddelen mogelijk maakt wanneer deze zorgvuldig wordt gevolgd. Bijzondere voorzichtigheid is geboden bij de volgende stappen: TrypLE- en DNAse I-vertering tijdens het genereren van eencellige suspensies, zaaien van eencellige suspensies in BME2, monitoring van organoïdegroei tot behandeling, mediaveranderingen en verstoring en lysis van BME2 ingebedde organoïden tijdens luminescentie-gebaseerde celoverlevingsuitlezing. (1) Hoewel aanvullende DNAse I-vertering na tryple-gebaseerde dissociatie van organoïden niet essentieel is voor het uitbreiden van organoïdemodellen tijdens regulier kweekonderhoud, mag DNAse I-vertering niet worden weggelaten bij het zaaien voor experimenten met medicijnescalatie, omdat dit zorgt voor een betere scheiding van organoïdeclusters in eencellige suspensies en nauwkeurige celtelling. (2) Het zaaien van eencellige suspensie in BME2 is een cruciale stap gezien de stolling van BME2 bij kamertemperatuur. Er moeten dus maximaal 1-2 rijen tegelijk worden gezaaid en monsters moeten op ijs worden geplaatst voordat extra rijen worden gezaaid. Van belang is dat cellen op en neer moeten worden gepipetteerd wanneer het zaaien wordt voortgezet om een homogene celsuspensie mogelijk te maken. (3) Organoïde groei moet zorgvuldig worden gecontroleerd tijdens de 7-daagse uitbreiding van zaaien tot behandeling. Een voorbeeld van de verwachte ontwikkeling is te zien in figuur 1B pt aanvullende tabel 1. Van belang is dat het beoordelen van veranderingen in organoïdegrootte door middel van brightfield-microscopie en beeldanalyse zoals weergegeven in figuur 1B een nauwkeurige evaluatie van verschillen in organoïdegroei en verdubbelingstijden mogelijk kan maken. Verdubbelingstijden kunnen een impact hebben op de respons op drugs, zoals onlangs besproken in de literatuur30. Als de organoïdegroeisnelheid het gepresenteerde voorbeeld aanzienlijk overschrijdt, kan een kortere expansietijd tot het begin van de behandeling en een kortere behandelingsduur worden overwogen. (4) Bovendien moet bijzondere aandacht worden besteed aan het veranderen van media om aanzuigende organoïden te voorkomen. De zaaipositie van BME2 ingebedde organoïden op de 6 uur positie zorgt voor een veilige aspiratie van media wanneer platen met de klok mee 180 ° worden gedraaid en media worden geaspireerd op de tegenovergestelde positie van de organoïden. (5) Ten slotte is een grondige lysis van in BME2 ingebedde organoïden tijdens de overlevingsuitlezing essentieel om nauwkeurige resultaten vast te leggen. Volgens de instructies van de fabrikant moeten monsters herhaaldelijk op en neer worden gepipetteerd, idealiter met behulp van ongefilterde tips, om een goede lysis te garanderen. Incubatietijden moeten worden gevolgd zoals beschreven. Verder zorgt het overbrengen van 75% van het lysaat (in plaats van het totale volume) naar een witte, ondoorzichtige bodemplaat met 96 putten voor de uiteindelijke uitlezing met behulp van een ELISA-plaatlezer voor een passende beoordeling, omdat dit hetzelfde volume in elke put garandeert en de afwezigheid van luchtbellen die kunnen worden geïntroduceerd door krachtig pipetteren.
Van belang is dat profilering van geneesmiddelresponsen in BME2-ingebedde organoïdeculturen een hogere standaarddeviatie kan vertonen dan waargenomen in reguliere cellijnculturen (figuur 2, figuur 3A). De hogere standaarddeviatie is gebaseerd op verschillende factoren, waaronder een verhoogde kans op kleine variaties in het zaaien bij het werken met BME2 en verschillen in individuele organoïde groeisnelheden tussen putten gedurende de initiële groeiperiode van 7 dagen. Er moeten dus gelijke of meer dan vier technische replicaties per geneesmiddelconcentratie worden gezaaid.
Het belangrijkste is dat de aanwezigheid van kwaadaardige cellen die de oncogene drivermutatie dragen en beperkte besmetting door normale luchtwegepitheelcellen zorgvuldig moeten worden geëvalueerd. Uitdagingen bij NSCLC-vestiging kunnen de uitgroei van normale luchtwegepitheelcellen bevorderen7. Copy number profiling of PCR- en sequencing-gebaseerde benaderingen om de aanwezigheid van de oncogene drivermutaties te bevestigen zijn de voorkeursmethoden om de kwaliteit van NSCLC-organoïde culturen te waarborgen.
Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Media en respectievelijke groeifactoren die worden toegevoegd aan basismedia-oplossingen kunnen de respons van geneesmiddelen op gerichte remmers aanzienlijk beïnvloeden. Ze activeren bypass-receptoren en signaalroutes die de respons van geneesmiddelen beïnvloeden en beperken (bijv. FGF, HGF, EGF)26. Hoewel een groeifactorrijke en op maat gemaakte media optimaal kan zijn voor het uitbreiden van de organoïdecultuur, moeten medicijnescalatie- en gevoeligheidsbeoordelingen worden uitgevoerd in een media met verminderde groeifactor, zoals hierboven beschreven. Dit is gebaseerd op interne ervaring met het vergelijken van verschillende mediaformuleringen en geneesmiddelresponsgegevens (figuur 3C). Hoewel media-oplossingen de mate van gevoeligheid voor bepaalde medicamenteuze behandeling kunnen beïnvloeden en IC50-waarden kunnen verschuiven, zijn robuuste fenotypen van gevoeligheid of resistentie duidelijk, ongeacht de mediaformulering (figuur 3C, D). Bovendien wordt algemene consistentie in de mediaformulering en profilering van geneesmiddelresponsen in organoïde culturen aanbevolen en moet een gelijke of meer dan vier technische replicaties per concentratie worden gezaaid. Dit is met name belangrijk om bandbreedtes in gevoeligheid versus. resistentie voor de remmer van belang.
Beperkingen van de methode
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft de gevoeligheid van NSCLC 3D-kankerorganoïdemodellen voor gerichte remmers wanneer van de patiënt afgeleide kankercellen worden gekweekt. Aanvullende experimenten, waaronder farmacodynamische analyse met betrekking tot pathway-inhibitie en sequencinganalyse voor de aanwezigheid van het driver-oncogen en secundaire mutaties, zijn nodig voor een gedetailleerde karakterisering van geneesmiddelresistentie en gevoeligheid. Verder worden omstanderfactoren zoals micromilieustimuli afgeleid van interacties of uitgescheiden factoren door niet-kanker omstandercellen in de tumormicro-omgeving niet meegenomen en zijn nieuwe protocollen nodig wanneer co-kweek organoïde modellen met immuun- of stromale cellen worden geprobeerd. Recent werk heeft het gebruik van organoïde modellen benadrukt om tumormicro-omgevingsinteracties en profielresponsen op immuuncheckpointremmers, zoals anti-PD-L1-behandeling13,31, samen te vatten.
De betekenis van de methode ten opzichte van bestaande / alternatieve methoden
3D kanker organoïde modellen recapituleren de genetische diversiteit en determinanten van de behandelingsrespons aanwezig in de oorspronkelijke tumor4,5,6. Met name ruimtelijke en temporele heterogeniteit kan tumorevolutie bevorderen, en parallelle opkomst en de sequentiële ontwikkeling van tumorsubklonen kunnen optreden32,33. Intratumor heterogeniteit is significant voor de selectie van meer veerkrachtige tumorcellen onder therapeutische druk9,34,35. Het protocol dat hier wordt verstrekt, maakt een snelle beoordeling mogelijk van gevoeligheden voor behandeling met gerichte remmers in patiënt-nabije monsters. Organoïdemodellen hebben dus voordelen ten opzichte van meer conventionele homogene cellijnmodellen zonder genetische diversiteit of langetermijnstudies met cellijnen of van de patiënt afgeleide xenografts. Verder maakt het huidige protocol het mogelijk om op te schalen naar meerdere behandelingsarmen en gecombineerde behandelingsbenaderingen met weinig beperkingen met betrekking tot kosten en analytische capaciteit. Als zodanig maakt het toevoegen van een tweede geneesmiddel van belang in een vaste dosis, terwijl de primair gerichte remmer wordt geëscaleerd en vergeleken met de escalatie van de primair gerichte remmer alleen, een efficiënte evaluatie van de potentiële combinatorische effecten en met minimale extra biomassa die nodig is (aanvullende figuur 3). Vergeleken met op beeldvorming gebaseerde beoordelingen die worden gebruikt om de ontwikkeling van organoïden en de respons op geneesmiddelen te volgen, heeft de hier beschreven op luminescentie gebaseerde celoverlevingstest een vergelijkbare gevoeligheid met minimale apparatuur en vereiste training.
Belang en mogelijke toepassingen van de methode in specifieke onderzoeksgebieden
Het ontwikkelen van een gestandaardiseerde pijplijn die het mogelijk maakt om kankerorganoïde modellen op te stellen van patiëntmonsters en de daaropvolgende medicijngevoeligheden profilering heeft een aanzienlijk klinisch toepasbaarheidspotentieel. Ex vivo farmacologische profilering heeft erkenning gekregen bij het detecteren van kwetsbaarheden en resistente kenmerken in tumoren, correlerend met de behandelingsrespons bij patiënten36,37. Het is veelbetekenend dat ex vivo profilering van geneesmiddelgevoeligheden kan helpen bij de selectie van behandelingen in de kliniek en het ontwerp van rationele combinatiebehandelingen die resistentiemechanismen aanpakken. Over het algemeen kan deze aanpak helpen om verbeterde gepersonaliseerde strategieën voor moleculaire therapie of combinatorische behandelingsregimes mogelijk te maken. Dit laatste kan helpen om de tolerantie- en resistentiemechanismen van geneesmiddelen vroegtijdig aan te pakken en de klinische respons te verdiepen om de resultaten van de patiënt in de toekomst te verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
We danken de laboratoria van Jeroen P Roose (UCSF) en Calvin J Kuo (Stanford) voor hun inbreng met betrekking tot organoïde cultuur en protocolontwikkeling. Verder bedanken we Oghenekevwe M. Gbenedio (Roose lab, UCSF) voor protocollen en input voor het opzetten van monsters. Dit onderzoeksproject werd uitgevoerd met steun van de NIH [U54CA224081]. F. Haderk werd ondersteund door de Mildred Scheel postdoctorale fellowship van de German Cancer Aid.
1.5 mL tubes | |||
15 mL centrifuge tubes | |||
500 mL Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.2 µm Pore 33.2 cm2 Nylon Membrane | Corning | 430773 | for both media |
96-Well, Cell Culture-Treated, Flat Clear Bottom Black Microplate | Corning | 3904 | |
96-Well, Cell Culture-Treated, Solid White Flat-Bottom Microplate | Corning | 3917 | |
A-8301 | Tocris Bioscience | 293910 | for both media |
Advanced DMEM/F-12 | Gibco | 12634010 | for LGM |
B27 | Life Technologies | 12587010 | for both media |
BioRender 2021 | https://biorender.com/ | online scientific illustration software | |
BME2 (Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2) | R&D Systems | 353301002 | |
Cell culture incubator (37 °C, 5% CO2) | |||
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9682 | 3D-CTG readout reagent |
Centrifuge holding 15 mL centrifuge tubes | |||
Deoxyribonuclease I (DNAse I) | ThermoFisher Scientific | 18047019 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution | Corning | MT21031CV | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Gibco | 10565018 | for GM |
GlutaMax | Gibco | 35050061 | for LGM |
GraphPad Prism software (version 9.2.0) | GraphPad | statistical analysis software | |
HEPES | Gibco | 15630080 | for both media |
hFGF-10 | PeproTech | 100-26-100ug | for GM |
hFGF-7 | PeproTech | 100-19-50ug | for GM |
hNoggin | PeproTech | 120-10C-100ug | for both media |
hRspondin | PeproTech | 120-38-100ug | for GM |
Low retention pipette tips, 20 µL (P20) | ThermoFisher Scientific | 2149P-05-HR | |
Low retention pipette tips, 200 µL (P200) | ThermoFisher Scientific | 2069-05-HR | |
Regular length pipette tips, 1000 µL (P1000) | ThermoFisher Scientific | 2179-HR | |
Multichannel pipette | |||
N-Acetylcysteine | Fisher Scientific | 50-424-777 | for both media |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636-100G | for both media |
Osimertinib | Selleck Checm | S7297 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine | Gibco | 10378016 | for LGM |
Penicillin/Streptomycin | Cytiva HyClone | SV30010 | for GM |
Pipettes (different sizes) | |||
Plate reader | Molecular Devices | SpectraMax M5 | equipment, alternative readers may be used |
Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | for GM |
SB202190 | Selleck Chem | S1077 | for GM |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | |
Vacuum pump and tubing | |||
Vi-CELL XR Cell Analyzer | Beckman Coulter | Vi-CELL XR | cell analyzer / counter |