يوضح هذا البروتوكول طريقة الشريط حول كيفية بناء مصفوفة دقيقة للأنسجة يدويا باستخدام كتل مانحة FFPE ذات أعماق مختلفة.
يعد المصفوفة الدقيقة للأنسجة (TMA) أداة بحثية مهمة يمكن من خلالها تمثيل العديد من عينات البارافين الثابتة من الفورمالين (FFPE) في كتلة بارافين واحدة. ويتحقق ذلك باستخدام نوى الأنسجة المستخرجة من المنطقة التي تهم كتل FFPE المانحة المختلفة وترتيبها في كتلة بارافين TMA واحدة. بمجرد بنائها ، يمكن استخدام أقسام من TMA المكتملة لإجراء دراسات الكيمياء المناعية ، والكروموجينيك ، والتهجين الفلوري في الموقع (FISH) و RNA ISH لتقييم التعبير عن البروتين بالإضافة إلى التعديلات الجينومية والنسخية في العديد من العينات في وقت واحد ، وبالتالي تقليل استخدام الأنسجة وتقليل تكاليف الكاشف. هناك العديد من تقنيات بناء TMA المختلفة. واحدة من أكثر طرق البناء شيوعا هي طريقة المتلقي ، والتي تعمل بشكل أفضل مع النوى من نفس الطول والتي يوصى بطول لا يقل عن 4 مم. لسوء الحظ ، يمكن استئصال كتل الأنسجة بشكل كبير أثناء عملية التشخيص ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى سماكة كتلة مانحة “غير مثالية” أقل من 4 مم. تركز المقالة الحالية والفيديو على طريقة الشريط اللاصق على الوجهين ؛ دليل بديل ، منخفض التكلفة ، سهل الاستخدام ، وطريقة سريعة لبناء TMAs منخفضة الكثافة (<50 نواة) متوافقة للغاية مع كتل المانحين غير المثالية هذه. يوفر هذا البروتوكول دليلا خطوة بخطوة حول كيفية بناء TMA باستخدام هذه الطريقة ، مع التركيز على الأهمية الحاسمة للمراجعة المرضية والتحقق من صحة ما بعد البناء.
تستخدم أنسجة الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE) على نطاق واسع في دراسات التعبير عن البروتين المورفولوجي والكيميائي المناعي1. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب أبحاث الاكتشاف فحص العديد من العلامات على عدد كبير من الأنسجة ، والتي يمكن أن تستنفد الأنسجة الثمينة. تم تقديم مصفوفة الأنسجة الدقيقة (TMA) في 1980s ، وهي أداة بحثية مهمة تجمع مناطق نموذجية صغيرة ذات أهمية من العديد من كتل الأنسجة FFPE المختلفة في كتلة بارافين واحدة ، مما يسمح بفحص العديد من عينات الأنسجة في وقت واحد2. وبالتالي ، فإن TMAs تتجنب الاستخدام المفرط لعينات الأنسجة الثمينة للغاية ، والنادرة في كثير من الأحيان ، مع تقليل التكاليف المرتبطة بإجراء تطبيقات المصب على العديد من العينات الفردية 3,4.
توجد العديد من التقنيات المختلفة لبناء TMAs5 ، بما في ذلك النهج الآلية وشبه اليدوية 6,7. تستخدم غالبية هذه الأساليب الأخيرة طريقة المتلقي ، حيث يتم إدخال نوى الأنسجة المثقوبة من كتل المانحين في قالب مسبق الصنع. ومع ذلك ، يوصى باستخدام كتل مانحة “مثالية” لا يقل سمكها عن 4 مم لهذه الطريقة 6,7. لسوء الحظ ، فإن كتل المانحين ، وخاصة تلك التي تم تقسيمها على نطاق واسع لأغراض التشخيص السريري قبل إتاحتها للبحث ، غالبا ما يكون سمكها أقل من 4 مم ، مما قد يستبعدها من الاستخدام في بناء TMA باستخدام طريقة المتلقي ، إذا كانت إعادة التضمين لتحقيق عمق 4 مم غير ممكنة أو مرغوب فيها. علاوة على ذلك ، يمكن لهذه الإجراءات في كثير من الأحيان استخدام مصفوفة دقيقة يدوية للأنسجة أو أدوات آلية باهظة الثمن لا يمكن الوصول إليها بسهولة أو بأسعار معقولة لمختبر الأبحاث العادي. في المقابل ، فإن طريقة الشريط اللاصق على الوجهين أو طريقة الشريط ، هي طريقة بناء TMA يدوية متوافقة مع كتل المانحين غير المثالية التي تستخدم مصفوفات الأنسجة المحمولة باليد غير المكلفة أو المتاحة على نطاق واسع أو القابلة لإعادة الاستخدام أو التي يمكن التخلص منها8،9،10. تعكس هذه الطريقة عملية البناء عن طريق صب الكتلة حول النوى المستقيمة المقلوبة التي تتدفق عند الانتهاء مع الجزء العلوي من التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMA) ، بغض النظر عن طول النواة. نتيجة لذلك ، توجد جميع العينات في أقسام TMA عند تقسيمها لأول مرة ، مما يسمح للمنشئ بالحصول على أقصى استفادة من هذه الكتل غير المثالية من البداية. وبالتالي ، فإن طريقة الشريط تمثل بديلا فعالا من حيث التكلفة ومجديا لمختبرات البحوث غير المتخصصة.
لا يخلو بناء TMA من تحدياته ، ويجب توخي الحذر عند اختيار مناطق الأنسجة لاستخراج النوى منها ، مما يجعل المراجعة المرضية جزءا مهما من عملية بناء TMA11,12. وبالتالي ، يهدف هذا البروتوكول إلى التأكيد على الأهمية العميقة للمراجعة المرضية في بناء TMA من خلال تسليط الضوء على بعض المزالق المرضية المرتبطة ببناء TMA التي يجب أن يكون الأفراد الذين يقومون ببناء واستخدام TMAs على دراية بها ، ولماذا يجب أن تستمر مراجعة علم الأمراض طوال عمر كتلة TMA.
ويوجز هذا البروتوكول الخطوات المتخذة في المختبر الأساسي التقني لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) لبناء اتفاقات TMA من كتل مانحة غير مثالية باستخدام طريقة الشريط؛ حيث ACSR هو مستودع حيوي تموله المعاهد الوطنية للصحة مخصص لجمع العينات الحيوية من أنسجة سرطان فيروس نقص المناعة البشرية وتوزيعها بشكل عادل من أجل تعزيز أبحاث الأورام الخبيثة لفيروس نقص المناعة البشرية.
أحد المكونات الأكثر أهمية في عملية بناء TMA هو مراجعة علم الأمراض لكتل مانحة FFPE التي سيتم من خلالها الحصول على نوى TMA4. أثناء المراجعة ، يقوم أخصائي علم الأمراض المعتمد من مجلس الإدارة بفحص قسم الأنسجة الملطخة H & E التمثيلي من كل كتلة مانحة. من الضروري أن يتم إنشاء H & E باستخدام قسم الأنسجة المقطوعة حديثا بحيث يكون أفضل تمثيل لكتلة المانحين المقابلة. لا ينصح باستخدام H & Es الأقدم نظرا لأن أنسجة FFPE هي هياكل ثلاثية الأبعاد يمكن أن يتغير ملف تعريف الأنسجة بشكل كبير مع عمق الكتلة والتقسيم الواسع ؛ قد يكون هذا قد حدث منذ إنشاء H & E ، مما قد يجعل تمثيله لكتلة FFPE غير دقيق. عملية الاستعراض ضرورية لاختيار الحالات المناسبة وتحديد مناطق الأنسجة التي ينبغي الحصول على النوى منها، فضلا عن تحديد المناطق التي ينبغي تجنبها عند جمع النوى. في غياب المراجعة المرضية ، يزداد احتمال تضمين الأنسجة غير المناسبة بشكل كبير. إن إدراج مثل هذه الأنسجة لديه القدرة على جعل TMA المبني غير فعال وغير مناسب للغرض المقصود منه. والأهم من ذلك، أن استخدام مثل هذه الاتفاقات غير الفعالة دون علم ينطوي على إمكانات هائلة لأن يؤدي إلى بيانات خاطئة ومضللة. هذا جنبا إلى جنب مع معرفة أن ملف تعريف أنسجة FFPE ، وبالتالي النوى المشتقة منها ، يمكن أن يتغير بشكل كبير مع زيادة العمق يسلط الضوء على أهمية المراجعة المستمرة لعلم الأمراض طوال عمر كتلة TMA المبنية. من الناحية المثالية ، يجب إنشاء H & Es باستخدامكل قسم 15أو 20 لضمان التقاط أي تغييرات في ملفات تعريف الأنسجة في النوى وتسجيلها. كحد أدنى ، يجب إنشاء H & Es ومراجعته في بداية ونهاية المشروع لمراقبة هذه التغييرات المحتملة. في ضوء هذه النقاط وأهمية TMA كأداة بحثية ، من الضروري أن تكون المراجعة المرضية مضمنة بقوة في عملية بناء TMA وطوال عمر كتلة TMA.
غالبا ما يتم تقسيم كتل FFPE على نطاق واسع أثناء المعالجة التشخيصية الروتينية قبل إطلاقها لأغراض البحث. ونتيجة لذلك ، غالبا ما يكون عمق كتلة المتبرع وبالتالي أطوال كتلة المتبرع الأساسية أقل من الطريقة المتلقية المثالية البالغة 4 مم. لقد أوضحنا هنا كيفية بناء TMAs باستخدام بروتوكول بناء طريقة الشريط ، والميزة الرئيسية له هي توافقه مع النوى من كتل أنسجة FFPE غير المثالية. على الرغم من أن طريقة الشريط ذات قيمة بحثية كبيرة وتوفر طريقة غير مكلفة ومريحة ويمكن الوصول إليها لبناء كتل TMA ، إلا أنها لا تخلو من التحديات والقيود. بالمقارنة مع كل من طرق المستلم الآلية واليدوية ، والتي يمكن أن تستوعب 100-1000s من النوى في كتلة TMA واحدة ، يوصى بحد أقصى 40 نواة ل TMAs التي تم إنشاؤها باستخدام طريقة الشريط9. وهناك قيد آخر يتعلق بسهولة البناء. في طريقة المتلقي ، يتم إدخال النوى المثقوبة فقط في قالب مسبق الصب ، والذي يوفر الاستقرار الأساسي عن طريق تغليف كل نواة في بئرها الفردية الخاصة بها ، وبالتالي منع هجرة النواة بالإضافة إلى تعزيز وضع النواة وفصلها بشكل منتظم للغاية22. علاوة على ذلك ، توفر طريقة المستلم الراحة الاختيارية لكونها يدوية بالكامل وشبه يدوية ومؤتمتة بالكامل. في المقابل ، تتطلب طريقة الشريط اليدوي وضعا دقيقا ولطيفا لكل نواة باليد باستخدام اختيار إبرة. على الرغم من أن عدم وجود قالب مسبق الصب في طريقة الشريط يحول دون التنسيب والفصل المنتظمين للغاية مع طريقة المتلقي ، إلا أنه يتم التغلب على هذا النقص من خلال تضمين شبكة متقلبة. من المهم أن يتم تثبيت الشبكة المتقلبة على وسط الدرج المعدني لتجنب وضع حافة الكتلة ، مما يزيد من خطر فقدان النواة إذا لم يكن هناك بارافين كاف يثبت اللب في مكانه. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن عمليات الفصل الأساسية الصغيرة الممكنة مع طريقة المتلقي لا يمكن تحقيقها باستخدام طريقة الشريط بسبب وضع النواة يدويا والحاجة إلى اختيار الإبرة لتناسب بين النوى المجاورة. يتم وضع النوى بطريقة منتصبة قائمة بذاتها مع أصغر مساحة سطح أو بصمة للقلب تلامس الشبكة المغطاة DSST. يوفر هذا الإعداد استقرارا أساسيا أقل بكثير من طريقة المستلم ويمنح خطرا معززا للانقلاب الأساسي و / أو الترحيل عند صب البارافين المنصهر. في الواقع ، واحدة من أهم الخطوات في البروتوكول هي صب البارافين المنصهر. من الضروري أن يتم ذلك بسرعة عند إزالته من الفرن لضمان أن البارافين سائل تماما وأن يتم إجراء الصب بلطف مع الحد الأدنى من الاضطراب. ومن المثير للاهتمام أن تشن وآخرون طوروا جهازا مساعدا جديدا للغاية ، يشبه الاستنسل مع ثقوب قطرها 2 مم موزعة بالتساوي 7 × 11 ، والتي يتم وضعها فوق كتلة بارافين فارغة لتوجيه الإبر عند إنشاء كتلة المتلقي وعند إدخال نوى كتلة المتبرع23. على الرغم من أنه مصمم للمساعدة في بناء كتلة المتلقي ، إلا أنه يمكن بسهولة تكييف هذا الجهاز مع طريقة الشريط لتوجيه الموضع وتنظيم الفصل وزيادة الاستقرار الأساسي أثناء عملية البناء.
واحدة من أهم المؤثرات على الاستقرار الأساسي هو عدد النوى المدرجة في طريقة الشريط TMA. ويرجع ذلك إلى أنه مع زيادة عدد النوى ، يجب أن ينخفض قطر النواة من أجل استيعاب العدد المتزايد من النوى ، مما يقلل بدوره من البصمة الأساسية التي تلتزم ب DSST. يوصى بقطر أساسي لا يقل عن 1 مم لبناء TMA بطريقة الشريط ، حيث وجدنا أن النوى ذات الأقطار الأصغر غير مستقرة بشكل خاص وعرضة للسقوط حتى مع صب البارافين اللطيف للغاية. شهدت دراسة حديثة تبحث في طريقتين مختلفتين داخليتين استخدمتا إبر 16 G (قطر القلب 1.1 مم) ولكمة قطرها 4 مم خسائر كبيرة في الأنسجة مع 1.1 مم (26.5٪) ولكن ليس النوى 4 مم24. يبدو أن هذا يشير إلى أن النوى الصغيرة يمكن أن تكون مشكلة في العمل معها وليس فقط أثناء البناء. علاوة على ذلك ، قد لا تمثل الأقطار الأصغر كتلة المتبرع الأصلية وكذلك النوى الأكبر ، مما يجعل التفسير المرضي صعبا ويزيد من احتمال تمثيل الأنسجة المانحة غير الدقيقة.
إن إدراج ووضع كتل التوجيه له أهمية عميقة في بناء TMA. ومع ذلك ، فإن هذا له أهمية خاصة لطريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMAs. ينبع هذا من حقيقة أن طريقة الشريط تعكس عملية البناء وبالتالي تزيد من خطر الارتباك المكاني. ننصح بتضمين ما يصل إلى ثلاثة نوى توجيه في كل كتلة ، وأن يتم وضعها بعيدا عن نوى العينة من أجل توجيه الكتلة بشكل أفضل. يمكن أن تكون نوى التوجيه عبارة عن نوى مأخوذة من كتل الأنسجة التي تحتوي على أنسجة مختلفة بشكل واضح عن موضوع TMA المبني أو أدوات التوجيه الملونة الخالية من الأنسجة21 ، حيث يكون الأخير مفيدا بشكل خاص لغير علماء الأمراض. جنبا إلى جنب مع وضع النواة المصفوفة غير المنتظمة ، تقلل نوى التوجيه من خطر الارتباك.
ينبع الاختلاف الواضح في الطول الأساسي بين التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي (TMAs) الذي تم بناؤه باستخدام الشريط وطرق المتلقي من إدراج عمق كتلة المانحين في عملية صنع القرار عند اختيار طريقة البناء. يستخدم البروتوكول الموضح هنا عتبة حيث يتم إنشاء TMAs باستخدام طرق الشريط والمتلقي عندما يكون للكتل المانحة أعماق <4 مم و 4 مم ، على التوالي. من المهم ملاحظة أن إدراج عمق كتلة المانحين في اختيار طريقة البناء ليس عالميا. على الرغم من أنه من الممكن بناء TMAs باستخدام أي من الطريقتين بغض النظر عن عمق الكتلة المانحة ، إلا أن النوى الأطول يمكن أن تتداخل مع ، أو يتم إسقاطها أو إمالتها ، وضع الكاسيت البلاستيكي أثناء بناء TMA باستخدام طريقة الشريط. يعتمد اختيار تضمين أو حذف المعايير في عملية صنع القرار على وسائل الراحة المتاحة للمختبر والتكلفة والمنتج النهائي المطلوب. بموجب معلمات هذا البروتوكول ، يكون عدد مقاطع TMA المثبتة على الشريحة والتي يمكن الحصول عليها من طريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMA أقل بكثير من تلك التي تم الحصول عليها من TMA الذي تم إنشاؤه بطريقة المستلم. على الرغم من أنه من الممكن إعادة حظر أنسجة FFPE لزيادة عمق كتلة المتبرع وجعلها متوافقة مع طريقة المتلقي ، إلا أن احتمال تحقيق نفس اتجاه الأنسجة داخل إعادة الكتلة منخفض. في المقابل ، قد يتطلب هذا مواجهة كتلة واسعة للحصول على قسم كامل الوجه ، والذي من المحتمل أن يشمل فقدان الأنسجة بشكل كبير. بعد مواجهة الكتلة ، تنتج طريقة الشريط التي تم إنشاؤها TMA ما يقرب من 50 قسما TMA مثبتا على الشريحة مع وجود جميع النوى. ومع ذلك ، فإن العدد الدقيق يختلف من كتلة إلى أخرى ويعتمد على طول النوى المستخدمة لبناء TMA وسماكة الأقسام التي يتم قطعها (5 ميكرومتر مقابل 4 ميكرومتر). وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة أيضا إلى أنه بسبب اختلاف أطوال النواة، فإن النوى سوف تستنفد في أوقات مختلفة حيث يتم تقسيم التحليل الحراري الميكانيكي الميكانيكي تدريجيا؛ سمة تؤكد من جديد على الحاجة إلى المراجعة المرضية المستمرة.
على الرغم من أن طريقة المتلقي تقدم فوائد ومزايا كبيرة على طريقة الشريط ، بما في ذلك عمليات بناء أقل مملة وأكثر سرعة ، فإن طريقة الشريط لا تستهدف مختبرات ذات إنتاجية عالية من ذوي الخبرة. وهو يستهدف المختبر العادي، ولا سيما في البيئات المحدودة الموارد، مع إمكانية الوصول إلى كتل المانحين ذات الأعماق المتغيرة ولكن ليس إلى خدمات البناء TMA. ومع ذلك، يمكن أن تشهد التطبيقات المستقبلية أتمتة هذه الطريقة من أجل تعزيز مجموعة العينات المؤهلة في المختبرات عالية الإنتاجية والقضاء على الحاجة إلى إعادة حجب كتل المانحين. في الختام ، يمكن بسهولة إنشاء بروتوكول بناء طريقة الشريط TMA الموصوف في المختبرات غير المتخصصة دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن. ومع ذلك ، ينصح بأن المستخدمين الجدد يجب أن يستخدموا كتل أنسجة FFPE بدون قيمة ، أو أدوات توجيه ملونة خالية من الأنسجة21 أو حتى كتل بارافين ملونة بدون أنسجة في البداية من أجل التعرف على تقنية طريقة الشريط قبل التقدم إلى بناء TMA باستخدام الأنسجة الثمينة. على الرغم من أن بنائها لا يخلو من المزالق المحتملة ، والتي يجب أن يكون كل من الذين يقومون ببناء واستخدام كتل TMA على دراية بها ، إلا أن طريقة بناء TMA “محلية الصنع” غير المصقولة على ما يبدو يمكن أن تسفر عن TMAs عالية الجودة وذات صلة بيولوجية للبحث. في الواقع ، تعد أقسام TMA النابعة من TMAs التي تم إنشاؤها بطريقة الشريط من بين أكثر عينات الأنسجة طلبا في المستودع الحيوي ACSR.
The authors have nothing to disclose.
تم توفير التمويل لهذا العمل من قبل المستودع الحيوي لموارد عينات الإيدز والسرطان (ACSR) الممول من المعاهد الوطنية للصحة (www.acsr1.com) ، UM1CA181255.
BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
cellSens imaging software | Olympus | x | |
Cotton Balls | FisherBrand | 22-456-880 | |
Double sided tape (removable) | Scotch | 383534 | |
DP72 camera | Olympus | DP72 | |
Economy Lab Oven | FisherBrand | 13246516GAQ | |
Forceps | Various | x | |
Formula "R" (paraffin) | Leica | 3801450 | |
Glass microscope slides | FisherBrand | 12-550-15 | |
Low Profile Micotome Blades | Accu-Edge | 4689 | |
Microtome | Leica | RM2265 | |
Permanent marker | Electron Microscope Sciences | 72109-12 | |
Quick Ray manual tissue microarrayer set | Unitma | UT06 | |
Stainless-Steel Base Molds | FisherBrand | 22-038-209 | |
Tissue Cassette Cooling Tray | Electron Microscope Sciences | 63314 | |
Tissue Processing/Embedding Cassette | FisherBrand | 15-182-701E | |
Waterbath | Triangle Biomedical Sciences | TFB-120 | |
Wooden stick | FisherBrand | 22363158 |