בידוד תאי אפיתל מזקיקי השיניים האנושיים
Summary
זקיק השיניים מכיל אוכלוסייה אפיתל ותאים mesenchymal. אוכלוסיית האפיתל נבחרה מתוך אוכלוסיית תאי הזקיק הדנטליים ההטרוגניים על ידי מתן מדיום תרבותי מובהק. תאי אפיתל שרדו ויצרו מושבות במדיום נטול סרום.
Abstract
זקיק השיניים (DF) נקצר במהלך הסרת שפונחת שלישית שהושפעה על ידי מנתח מקסילופסיאלי אוראלי. בידוד תאי אפיתל בוצע ביום קציר DF. DF נשטף שלוש פעמים עם DPBS ולאחר מכן נותח עם מספריים רקמה עד הרקמה היה עקביות מעופשת או מעוך. אוכלוסיות חד-תאיות הושמטו על ידי צנטריפוגה ונשטפו עם מדיום נטול סרום קרטינוציטים. אוכלוסיות תאים הטרוגניות חולקו בצלחת תרבות. קרטינוציטים ללא סרום מדיום שימש לבחירת תאי האפיתל. מדיום התרבות השתנה מדי יום עד שלא נצפו פסולת צפה או תאים מתים. תאי אפיתל הופיעו בתוך 7-10 ימים לאחר התפלגות אוכלוסיית התאים. תאי אפיתל שרדו במדיום נטול סרום, בעוד α שינוי בינוני חיוני מינימלי בתוספת 10% סרום בקר עוברי אפשר את התפשטותם של תאים מסוג mesenchymal. DF הוא מקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל שיניים.
מטרת המחקר הייתה ליצור שיטה לבידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי. רצועה חניכיים (PDL) שימש לבידוד של תאי אפיתל שיניים אנושיים. רכישת תאי אפיתל מ- PDL אנושי אינה תמיד מוצלחת בשל נפח הרקמות הקטן, מה שמוביל למספרים נמוכים של תאי אפיתל. ל-DF יש אמצעי אחסון גדול יותר מ-PDL והוא מכיל יותר תאים. DF יכול להיות מקור רקמה לתרבות העיקרית של תאי אפיתל שיניים אנושיים. פרוטוקול זה קל ויעיל יותר משיטת הבידוד המשתמשת ב-PDL. רכישת תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויה להקל על מחקרים נוספים של אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים.
Introduction
היווצרות השן מתחילה עם ההשתנות של האפיתל האוראלי1. על פי השלב ההתפתחותי של השן, לאפיתל הפה יש שמות שונים, כולל אפיתל אמייל פנימי וחיצוני, לולאת צוואר הרחם, ונדן השורש האפיתל של הרטוויג (HERS). תאי האפיתל מתקשרים עם התאים המנשימליים שמסביב. אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות לווסת היווצרות שיניים והתחדשות רקמות. רכישת תאי אפיתל דנטליים, כגון קרטינוציטים אוראליים ותאי נדן השורש האפיתל של Hertwig (HERSCs), חיונית לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות דנטליות2.
תאי אפיתל דנטליים שמקורם במכרסמים מבודדים ממבנה האפיתל, כגון HERS. לי ועמיתיו בודדו והנציחו את ה-HERSCs שמקורם בחולדות לאחר שקצרו את החלק האפירי של חיידקי השיניים המתפתחים מעכברושים בני 8 ימים3. ה-HERS הופרד מרקמה אפית תחת הגדלה. בהתחשב בשלב התפתחותי השן ובגיל, קצירת HERS מבני אדם היא כמעט בלתי אפשרית בגלל בעיות אתיות: חיידק שן מתפתח צריך להיות מוסר מילד צעיר כדי לקצור את HERS האנושי. חיידקי שיניים לא בוגרים מופקים לעתים רחוקות. תאי אפיתל שיניים אנושיים יכולים להיות מבודדים מן הגינגיבה ואת הרצועה חניכיים (PDL). תאים שמקורם במבנה אפיתל משתתפים בהיווצרות שיניים יחד עם רכיבים מזנכימליים ועשויים להתאים יותר לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות דנטליות מאשר קרטינוציטים אוראליים. שאריות תא אפיתל של Malassez (ERM) הם שרידי אפיתל שמקורם HERS ושוכנים במספרים קטנים ב- PDL4. מחקרים מדווחים על בידוד של HERSCs אנושי מ PDL5. עם זאת, קצירת HERSCs אנושי מרקמת PDL לא תמיד מוצלח בגלל המחסור של האוכלוסייה האפיתלית במיקום זה5,6.
למרות HERSCs נגזר מכרסמים נשמרים ב media3,7 המכיל סרום, תאי אפיתל אנושיים נגזר DF הם תרבית עם מדיה ללא סרום דומה לתאי אפיתל אנושיים אחרים, כגון קרטינוציטים אפידרמיס אנושי נורמלי וקרטינוציטים אוראליים אנושי נורמלי8,9. זה מרמז על הבדלים פיזיולוגיים או תפקודיים בין תאי אפיתל שיניים מכרסמים ותאי אפיתל שיניים אנושיים. הבנת המנגנון לגבי אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות שיניים עשויה לתרום להתפתחות יישומים קליניים, כולל חיבור חניכיים במהלך נטיעה מחדש, התחדשות חניכיים במחלת חניכיים, התחדשות קומפלקס עיסת-דנטין, ויצירת ביו-שן. בהתחשב במאפייני המחקר התרגומי, תאי אפיתל שיניים אנושיים עשויים להיות מתאימים יותר מתאי אפיתל דנטלי מכרסמים לחקר אינטראקציות אפיתל-מזנכימליות.
DF האנושי הוא רקמת חיבור רופפת ולעתים קרובות שוכן בשן מושפעת. DF מכיל מבשרים mesenchymal10. עם זאת, למיטב ידיעתנו, אף מחקר לא דיווח על בידוד של תאי אפיתל מזקיקי שיניים לפני 2021. הו ויי דיווחו על בידוד תאי אפיתל מ-DF אנושי בשנת 20218. הפנוטיפ האפיתל אושר על ידי ניתוח סופג ומורפולוגי מערבי. ניתוח מקורם של תאי אפיתל שמקורם ב-DF הדגים תוצאות דומות עם מחקרים אחרים. תאי אפיתל שמקורם ב-DF לא היו אנדותל ולא hematopoietic5,11, ו-Oh ו-Yi הציעו לקרוא לתאים אלה כ-DF-HERSCs. ל- DF יש נפח גדול יותר מה- PDL, וניתן לבודד תאים אפיתל יותר מה- DF. זה משפר את הופעתם של מושבות אפיתל ותוצאות שיעור הצלחה גבוה בקציר תאי אפיתל מ- DF. מחקר זה מציע להשתמש ב- DF כמקור רקמה לבידוד של תאי אפיתל דנטליים.
במחקר הנוכחי, תאים בודדים היו מבודדים מן DF על פי נהלים שתוארו בעבר10,12. ה- DF מכיל אוכלוסיות תאים הטרוגניים, ומספר סוגי תאים עשויים להיות נוכחים בשלב המוקדם של ההליך. מורצ’ק ועמיתיו בודדו תאי גזע מזנכימליים שמקורם ב-DF10. שיערנו כי DF מכיל תאי אפיתל וכי רק תאי אפיתל יכולים לשרוד בתנאים ללא סרום. מחקר זה שונה מזה של מורצ’ק ואח ‘ במונחים של בחירת האוכלוסייה האפיתלית ועיכוב של תאים mesenchymal. הבחירה בוצעה באמצעות מדיה נטולת סרום קרטינוציט (SFM), המאפשרת התפשטות תאי אפיתל ומעכבת את התפשטות התאים המנשימליים. מחקר זה מקורו בדו”ח של Oh ו- Yi8. מטרת מחקר זה הייתה לתאר פרטים על השיטה המשמשת בדו”ח זה לבידוד תאי אפיתל מ- DF אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה כולל שלבים קריטיים. קצירת אוכלוסיות חד-תאיות חיונית לבידוד מוצלח של תאי אפיתל מ-DF. ביקשנו לבודד תאי אפיתל מה-DF בהתבסס על ההשערה שלנו שיש יותר תאי אפיתל ב-DF. הליך הכרייה משפר את הניתוק והשחרור של תאים מה- DF. הליך הכרייה שופר, וכרייה חוזרת על עצמה עד DF נראה pulpy כדי להקל על שחרור של תאי…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מקרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (NRF-2017R1C1B2008406 ו- NRF-2021R1F1A1064350). ד”ר הי-יון באי סיפק בחביבות את ה-DF לתרבות העיקרית.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
Referências
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologia do Desenvolvimento. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
