从人牙囊中分离上皮细胞
Summary
牙囊含有上皮群和间充质细胞。通过提供独特的培养基，从异质性牙卵泡细胞群中选择上皮群体。上皮细胞存活并在无血清培养基中形成菌落。
Abstract
牙囊（DF）是在口腔颌面外科医生切除受影响的第三磨牙期间收获的。在DF收获当天进行上皮细胞分离。用DPBS洗涤DFBS三次，然后用组织剪刀解剖，直到组织具有浆状或粘稠度。通过离心造粒单细胞群并用角质形成细胞无血清培养基洗涤。异质细胞群分布在培养皿中。使用角质形成细胞血清无培养基选择上皮细胞。每天更换培养基，直到没有观察到漂浮的碎片或死细胞。上皮细胞在细胞群分布后7-10天内出现。上皮细胞在无血清培养基中存活，而α修饰的最小必需培养基补充10%胎牛血清允许间充质型细胞增殖。DF是分离牙齿上皮细胞的组织源。
本研究的目的是建立一种从人DF中分离上皮细胞的方法。牙周韧带（PDL）用于分离人牙齿上皮细胞。由于组织体积小，从人PDL获取上皮细胞并不总是成功的，导致上皮细胞数量少。DF的体积比PDL大，并且包含更多的细胞。DF可以是人牙齿上皮细胞原代培养的组织来源。该协议比使用PDL的隔离方法更容易，更有效。获取人类牙齿上皮细胞可能有助于进一步研究牙齿上皮 – 间充质相互作用。
Introduction
牙齿形成始于口腔上皮的内陷1。根据牙齿发育阶段，口腔上皮有不同的名称，包括内外珐琅质上皮，宫颈袢和赫特维格上皮根鞘（HERS）。上皮区室与周围的间充质细胞相通。上皮-间充质相互作用调节牙齿形成和组织再生。获取牙齿上皮细胞，如口腔角质形成细胞和赫特维格上皮根鞘细胞（HERSC），对于研究牙齿上皮-间充质相互作用至关重要2。
啮齿动物来源的牙齿上皮细胞从上皮结构中分离出来，例如HERS。Li及其同事在收获了8日龄大鼠发育中的牙齿胚芽的顶端部分后，分离并永生化了大鼠摩尔衍生的HERSC3。HERS在放大镜下从顶端组织分离出来。考虑到牙齿发育阶段和年龄，由于伦理问题，从人类身上收获HERS几乎是不可能的：需要从幼儿身上去除发育中的牙齿胚芽才能收获人类的HERS。未成熟的牙齿细菌很少被提取。人牙齿上皮细胞可以从牙龈和牙周韧带（PDL）中分离出来。上皮结构衍生的细胞与间充质成分一起参与牙齿的形成，并且可能比口腔角质形成细胞更适合研究牙齿上皮 – 间充质相互作用。Malassez（ERM）的上皮细胞残留物是HERS衍生的上皮残留物，并且少量存在于PDL4中。研究报告了人类HERSC与PDL5的分离。然而，从PDL组织中收获人类HERSC并不总是成功的，因为该位置上皮种群的稀缺性5，6。
虽然啮齿类动物来源的 HERSC 维持在含血清的培养基中3，7，但人 DF 来源的上皮细胞是用类似于其他人上皮细胞的无血清培养基培养的，例如正常人表皮角质形成细胞和正常人口腔角质形成细胞8，9。这意味着啮齿动物牙齿上皮细胞和人牙齿上皮细胞之间的生理或功能差异。了解牙齿上皮 – 间充质相互作用的机制可能有助于临床应用的发展，包括再植期间的牙周重新附着，牙周病中的牙周再生，牙髓 – 牙本质复合物再生和生物牙齿生成。考虑到转化研究的特点，人牙齿上皮细胞可能比啮齿动物牙齿上皮细胞更适合研究上皮-间充质相互作用。
人类DF是松散的结缔组织，通常位于受累的牙齿中。DF含有间充质前体10。然而，据我们所知，没有研究报告在2021年之前从牙囊中分离出上皮细胞。Oh和Yi在20218年报告了从人类DF中分离出上皮细胞的情况。通过蛋白质印迹和形态学分析证实上皮表型。对DF衍生上皮细胞起源的分析显示出与其他研究相似的结果。DF来源的上皮细胞既不是内皮细胞也不是造血细胞5，11，Oh和Yi建议将这些细胞命名为DF-HERSC。DF的体积大于PDL，并且可以从DF中分离出更多的上皮细胞。这增强了上皮菌落的出现，并导致从DF中收获上皮细胞的成功率很高。这项研究建议使用DF作为分离牙齿上皮细胞的组织源。
在本研究中，根据先前描述的程序从DF中分离出单个细胞10，12。DF包含异质性细胞群，并且在手术的早期阶段可能存在几种细胞类型。Morsczek及其同事分离出DF衍生的间充质干细胞10。我们假设DF含有上皮细胞，只有上皮细胞才能在无血清条件下存活。这项研究与Morsczek等人在上皮群体的选择和间充质细胞的抑制方面有所不同。选择使用角质形成细胞血清无培养基（SFM）进行，其允许上皮细胞增殖并抑制间充质细胞增殖。这项研究起源于Oh和Yi8的一份报告。本研究的目的是描述该报告中使用的从人DF中分离上皮细胞的方法的细节。
Protocol
Representative Results
Discussion
此协议包括关键步骤。收获单细胞群对于从DF中成功分离上皮细胞至关重要。我们试图根据我们的假设从DF中分离出上皮细胞，即DF中有更多的上皮细胞。切碎程序增强了细胞从DF的分离和释放。切碎过程得到改善，并重复切碎，直到DF出现浆状，以促进单细胞的释放。获得最大数量的单细胞增加了上皮群体出现的可能性。在从DF中分离上皮细胞期间经常发生污染。使用40μm过滤器可最大限度地减少?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助，该基金会由韩国政府资助（NRF-2017R1C1B2008406和NRF-2021R1F1A1064350）。Hee-Yeon Bae博士为初级培养提供了DF。
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
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