Isolatie van epitheelcellen uit menselijke tandheelkundige follikel
Summary
De tandheelkundige follikel bevat een epitheliale populatie en mesenchymale cellen. De epitheliale populatie werd geselecteerd uit de heterogene tandheelkundige follikelcelpopulatie door een afzonderlijk kweekmedium te bieden. Epitheelcellen overleefden en vormden kolonies in een serumvrij medium.
Abstract
De tandheelkundige follikel (DF) werd geoogst tijdens het verwijderen van een aangetaste derde kies door een orale maxillofaciale chirurg. Epitheelcelisolatie werd uitgevoerd op de dag van de DF-oogst. De DF werd drie keer gewassen met DPBS en vervolgens ontleed met een weefselschaar totdat het weefsel een pulpachtige of squishy consistentie had. Eencellige populaties werden gepelletiseerd door centrifugering en gewassen met keratinocyten serumvrij medium. Heterogene celpopulaties werden verdeeld in een kweekschaal. Keratinocyten serumvrij medium werd gebruikt om de epitheelcellen te selecteren. Het kweekmedium werd dagelijks verwisseld totdat er geen drijvend puin of dode cellen werden waargenomen. Epitheelcellen verschenen binnen 7-10 dagen na de verdeling van de celpopulatie. Epitheelcellen overleefden in serumvrij medium, terwijl α-modificatie minimaal essentieel medium aangevuld met 10% foetaal runderserum de proliferatie van mesenchymale cellen mogelijk maakte. De DF is een weefselbron voor de isolatie van tandheelkundige epitheelcellen.
Het doel van deze studie was om een methode vast te stellen voor de isolatie van epitheelcellen van menselijke DF. Parodontaal ligament (PDL) werd gebruikt voor de isolatie van menselijke tandheelkundige epitheelcellen. Het verkrijgen van epitheelcellen van menselijke PDL is niet altijd succesvol vanwege het kleine weefselvolume, wat leidt tot lage aantallen epitheelcellen. DF heeft een groter volume dan PDL en bevat meer cellen. DF kan een weefselbron zijn voor de primaire kweek van menselijke tandheelkundige epitheelcellen. Dit protocol is eenvoudiger en efficiënter dan de isolatiemethode met PDL. Het verkrijgen van menselijke tandheelkundige epitheelcellen kan verdere studies van tandheelkundige epitheliale-mesenchymale interacties vergemakkelijken.
Introduction
Tandvorming begint met de invaginatie van het orale epitheel1. Volgens het tandontwikkelingsstadium heeft het orale epitheel verschillende namen, waaronder het binnenste en buitenste glazuurepitheel, cervicale lus en hertwig’s epitheliale wortelschede (HERS). De epitheelcompartimenten communiceren met de omliggende mesenchymale cellen. Epitheliale-mesenchymale interacties reguleren tandvorming en weefselregeneratie. Het verkrijgen van tandheelkundige epitheelcellen, zoals orale keratinocyten en Hertwig’s epitheliale wortelschedecellen (HERSC’s), is cruciaal voor de studie van tandheelkundige epitheliale-mesenchymale interacties2.
Van knaagdieren afgeleide tandheelkundige epitheelcellen worden geïsoleerd uit de epitheelstructuur, zoals de HERS. Li en collega’s isoleerden en vereeuwigden ratkiezen-afgeleide HERSC’s na het oogsten van het apicale deel van de zich ontwikkelende tandkiemen van 8 dagen oude ratten3. Het HERS werd onder vergroting gescheiden van apicale weefsel. Gezien het ontwikkelingsstadium en de leeftijd van de tand, is het oogsten van de HERS van mensen bijna onmogelijk vanwege ethische kwesties: een zich ontwikkelende tandkiem moet van een jong kind worden verwijderd om de menselijke HERS te oogsten. Onrijpe tandkiemen worden zelden geëxtraheerd. Menselijke tandheelkundige epitheelcellen kunnen worden geïsoleerd uit het tandvlees en het parodontale ligament (PDL). Epitheliale structuur-afgeleide cellen nemen deel aan tandvorming samen met mesenchymale componenten en kunnen meer geschikt zijn voor de studie van tandheelkundige epitheliale-mesenchymale interacties dan orale keratinocyten. Epitheelcelresten van Malassez (ERM) zijn hers-afgeleide epitheliale restanten en verblijven in kleine aantallen in de PDL4. Studies melden de isolatie van menselijke HERSC’s van PDL5. Het oogsten van menselijke HERSC’s uit PDL-weefsel is echter niet altijd succesvol vanwege de schaarste van de epitheliale populatie op deze locatie5,6.
Hoewel van knaagdieren afgeleide HERSC’s worden gehandhaafd in serumbevattende media3,7, worden menselijke DF-afgeleide epitheelcellen gekweekt met serumvrije media die vergelijkbaar zijn met andere menselijke epitheelcellen, zoals normale menselijke epidermale keratinocyten en normale menselijke orale keratinocyten8,9. Dit impliceert fysiologische of functionele verschillen tussen tandheelkundige epitheelcellen van knaagdieren en menselijke tandheelkundige epitheelcellen. Inzicht in het mechanisme met betrekking tot tandheelkundige epitheliaal-mesenchymale interacties kan bijdragen aan de ontwikkeling van klinische toepassingen, waaronder parodontale herbevestiging tijdens herplanting, parodontale regeneratie bij parodontitis, pulp-dentine complex regeneratie en bio-tandgeneratie. Gezien de kenmerken van translationeel onderzoek, kunnen menselijke tandheelkundige epitheelcellen geschikter zijn dan knaagdier tandheelkundige epitheelcellen voor de studie van epitheel-mesenchymale interacties.
De menselijke DF is een los bindweefsel en bevindt zich vaak in een aangetaste tand. De DF bevat mesenchymale voorlopers10. Voor zover wij weten, heeft echter geen enkele studie de isolatie van epitheelcellen uit tandzakjes vóór 2021 gemeld. Oh en Yi meldden de isolatie van epitheelcellen van menselijke DF in 20218. Het epitheliale fenotype werd bevestigd door western blotting en morfologische analyse. Analyse van de oorsprong van DF-afgeleide epitheelcellen toonde vergelijkbare resultaten met andere studies. DF-afgeleide epitheelcellen waren noch endotheel noch hematopoietisch5,11, en Oh en Yi stelden voor om deze cellen als DF-HERSC’s te benoemen. De DF heeft een groter volume dan de PDL en er kunnen meer epitheelcellen uit de DF worden geïsoleerd. Dit verbetert de opkomst van epitheliale kolonies en resulteert in een hoog slagingspercentage bij het oogsten van epitheelcellen uit DF. Deze studie suggereert het gebruik van de DF als een weefselbron voor de isolatie van tandheelkundige epitheelcellen.
In de huidige studie werden afzonderlijke cellen geïsoleerd uit de DF volgens eerder beschreven procedures10,12. De DF bevat heterogene celpopulaties en verschillende celtypen kunnen in een vroeg stadium van de procedure aanwezig zijn. Morsczek en collega’s isoleerden DF-afgeleide mesenchymale stamcellen10. We veronderstelden dat de DF epitheelcellen bevat en dat alleen epitheelcellen kunnen overleven onder serumvrije omstandigheden. Deze studie verschilt van die van Morsczek et al. in termen van de selectie van de epitheliale populatie en de remming van mesenchymale cellen. De selectie werd uitgevoerd met behulp van keratinocyten serumvrije media (SFM), die epitheelcelproliferatie mogelijk maken en mesenchymale celproliferatie remmen. Deze studie is voortgekomen uit een rapport van Oh en Yi8. Het doel van deze studie was om details te beschrijven van de methode die in dat rapport wordt gebruikt voor de isolatie van epitheelcellen van menselijke DF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol bevat kritieke stappen. Het oogsten van eencellige populaties is essentieel voor de succesvolle isolatie van epitheelcellen van DF. We probeerden epitheelcellen te isoleren van de DF op basis van onze hypothese dat er meer epitheelcellen in de DF zijn. De gehaktprocedure verbetert de loslating en afgifte van cellen uit de DF. De gehaktprocedure werd verbeterd en het hakken werd herhaald totdat de DF pulpy leek om de afgifte van afzonderlijke cellen te vergemakkelijken. Het verkrijgen van het maximale aantal …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Research Foundation of Korea (NRF) gefinancierd door de Koreaanse overheid (NRF-2017R1C1B2008406 en NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae was zo vriendelijk om de DF te leveren voor primaire cultuur.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
Referências
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologia do Desenvolvimento. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
