Isolering av epitelceller fra human tannsekk
Summary
Tannsekken inneholder en epitelpopulasjon og mesenchymale celler. Epitelpopulasjonen ble valgt ut fra den heterogene tannsekkcellepopulasjonen ved å gi et tydelig kulturmedium. Epitelceller overlevde og dannet kolonier i et serumfritt medium.
Abstract
Tannsekken (DF) ble høstet under fjerning av en påvirket tredje molar av en oral maxillofacial kirurg. Epitelial celleisolasjon ble utført på dagen for DF-høsting. DF ble vasket tre ganger med DPBS og deretter dissekert med vev saks til vevet hadde en pulpy eller squishy konsistens. Encellede populasjoner ble pelletert av sentrifugering og vasket med keratinocytt serumfritt medium. Heterogene cellepopulasjoner ble distribuert i en kulturrett. Keratinocytt serumfritt medium ble brukt til å velge epitelceller. Kulturmediet ble endret daglig til ingen flytende rusk eller døde celler ble observert. Epitelceller dukket opp innen 7-10 dager etter cellepopulasjonsfordeling. Epitelceller overlevde i serumfritt medium, mens α modifikasjon minimalt viktig medium supplert med 10% foster bovint serum tillot spredning av mesenchymale celler. DF er en vevskilde for isolering av tannepitelceller.
Hensikten med denne studien var å etablere en metode for isolering av epitelceller fra human DF. Periodontal ligament (PDL) ble brukt til isolering av humane tannepitelceller. Å anskaffe epitelceller fra human PDL er ikke alltid vellykket på grunn av det lille vevsvolumet, noe som fører til lavt antall epitelceller. DF har et større volum enn PDL og inneholder flere celler. DF kan være en vevskilde for primærkulturen til humane tannepitelceller. Denne protokollen er enklere og mer effektiv enn isolasjonsmetoden ved hjelp av PDL. Anskaffelse av humane tannepiteringsceller kan legge til rette for videre studier av dental epitel-mesenchymale interaksjoner.
Introduction
Tanndannelse begynner med invaginering av det orale epitelet1. Ifølge tannutviklingsstadiet har det orale epitelet forskjellige navn, inkludert indre og ytre emalje epitel, cervical loop og Hertwigs epiteliale rothylse (HERS). Epitelrommene kommuniserer med de omkringliggende mesenchymale cellene. Epitelial-mesenchymale interaksjoner regulerer tanndannelse og vevregenerering. Anskaffelse av tannepitelceller, som orale keratinocytter og Hertwigs epiteliale rothylseceller (HERSCer), er avgjørende for studiet av dental epitelial-mesenchymale interaksjoner2.
Gnageravledede tannepitelceller er isolert fra epitelstrukturen, som HERS. Li og kollegene isolerte og udødeliggjorte rottemolar-avledede HERSC-er etter høsting av den apikale delen av de utviklende tannbakteriene fra 8-dagers gamle rotter3. HERS ble skilt fra apikalt vev under forstørrelse. Tatt i betraktning tannutviklingsstadiet og alderen, er høsting av HERS fra mennesker nesten umulig på grunn av etiske problemer: En utviklende tannkim må fjernes fra et lite barn for å høste det menneskelige HERS. Umodne tannbakterier blir sjelden ekstrahert. Humane dental epitelceller kan isoleres fra gingiva og periodontal ligament (PDL). Epiteliale struktur-avledede celler deltar i tanndannelse sammen med mesenchymale komponenter og kan være mer egnet for studiet av dental epitelial-mesenchymal interaksjoner enn orale keratinocytter. Epitelcellestøtter av Malassez (ERM) er HERS-avledede epitelrester og ligger i små mengder i PDL4. Studier rapporterer om isolering av menneskelige HERSC-er fra PDL5. Imidlertid er høsting av menneskelige HERSC-er fra PDL-vev ikke alltid vellykket på grunn av knappheten på epitelpopulasjonen på dette stedet5,6.
Selv om gnager-avledede HERSC-er opprettholdes i serumholdige medier3,7, dyrkes humane DF-avledede epitelceller med serumfrie medier som ligner på andre humane epitelceller, for eksempel normale humane epidermale keratinocytter og normale humane orale keratinocytter8,9. Dette innebærer fysiologiske eller funksjonelle forskjeller mellom gnager dental epitelceller og humane dental epitelceller. Forståelse av mekanismen for dental epitelial-mesenchymal interaksjoner kan bidra til utvikling av kliniske applikasjoner, inkludert periodontal reattachment under replantering, periodontal regenerering i periodontal sykdom, pulp-dentin kompleks regenerering, og bio-tann generasjon. Tatt i betraktning egenskapene til translasjonell forskning, kan humane tannepiteleceller være mer hensiktsmessige enn gnager dental epitelceller for studiet av epitel-mesenchymale interaksjoner.
Den menneskelige DF er et løs bindevev og ligger ofte i en påvirket tann. DF inneholder mesenchymale forløpere10. Men så vidt vi vet, har ingen studier rapportert om isolering av epitelceller fra tannsekkene før 2021. Oh og Yi rapporterte isolering av epitelceller fra human DF i 20218. Den epiteliale fenotypen ble bekreftet av vestlig blotting og morfologiske analyser. Analyse av opprinnelsen til DF-avledede epitelceller viste lignende resultater med andre studier. DF-avledede epitelceller var verken endotel- eller hematopoietiske5,11, og Oh og Yi foreslo å navngi disse cellene som DF-HERSCer. DF har et større volum enn PDL, og flere epitelceller kan isoleres fra DF. Dette forbedrer fremveksten av epitelkolonier og resulterer i en høy suksessrate i høsting av epitelceller fra DF. Denne studien antyder bruk av DF som vevskilde for isolering av tannepitelceller.
I den nåværende studien ble enkeltceller isolert fra DF i henhold til tidligere beskrevne prosedyrer10,12. DF inneholder heterogene cellepopulasjoner, og flere celletyper kan være til stede på det tidlige stadiet av prosedyren. Morsczek og kolleger isolerte DF-avledede mesenchymale stamceller10. Vi antok at DF inneholder epitelceller og at bare epitelceller kan overleve under serumfrie forhold. Denne studien skiller seg fra morsczek et al. når det gjelder valg av epitelpopulasjon og hemming av mesenchymale celler. Utvalget ble utført ved hjelp av keratinocytt serumfrie medier (SFM), som tillater epitelcelleproliferasjon og hemmer mesenchymal celleproliferasjon. Denne studien stammer fra en rapport fra Oh og Yi8. Målet med denne studien var å beskrive detaljer om metoden som ble brukt i denne rapporten for isolering av epitelceller fra human DF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen inneholder kritiske trinn. Høsting av encellede populasjoner er avgjørende for vellykket isolasjon av epitelceller fra DF. Vi søkte å isolere epitelceller fra DF basert på vår hypotese om at det er flere epitelceller i DF. Mincing prosedyren forbedrer løsrivelse og frigjøring av celler fra DF. Mincing prosedyren ble forbedret, og mincing gjentatt til DF dukket opp pulpy for å lette utgivelsen av enkeltceller. Å oppnå maksimalt antall enkeltceller øker sannsynligheten for fremveksten av epite…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av tilskudd fra National Research Foundation of Korea (NRF) finansiert av den koreanske regjeringen (NRF-2017R1C1B2008406 og NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae sørget for DF for primærkultur.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
Referências
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologia do Desenvolvimento. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
