Isolering av epitelceller från mänsklig tandsäck
Summary
Tandfollikeln innehåller en epitelpopulation och mesenkymala celler. Epitelpopulationen valdes från den heterogena tandsäckscellpopulationen genom att tillhandahålla ett distinkt odlingsmedium. Epitelial celler överlevde och bildade kolonier i ett serumfritt medium.
Abstract
Tandsäcken (DF) skördades under avlägsnandet av en påverkad tredje molar av en muntliga maxillofacial kirurg. Epitelial cell isolering utfördes på dagen för DF skörd. DF tvättades tre gånger med DPBS och dissekerades sedan med vävnad sax tills vävnaden hade en pulpy eller squishy konsistens. Encelliga populationer pelleterades av centrifugering och tvättades med keratinocyt serum-free medium. Heterogena cellpopulationer fördelades i en kulturrätt. Keratinocyt serum-free medium användes för att välja epitelial celler. Odlingsmediet ändrades dagligen tills inga flytande skräp eller döda celler observerades. Epitelial celler uppträdde inom 7-10 dagar efter cellpopulation distribution. Epitelial celler överlevde i serum-fria medium, medan α-modifiering minimalt väsentliga medium kompletteras med 10% fetala nötkreatur serum tillät spridning av mesenchymal-typ celler. DF är en vävnadskälla för isolering av tandepiteceller.
Syftet med denna studie var att fastställa en metod för isolering av epitelceller från mänskliga DF. Parodontala ligament (PDL) användes för isolering av mänskliga tandläkare epitelial celler. Att anskaffa epitelceller från humant PDL är inte alltid framgångsrikt på grund av den lilla vävnadsvolymen, vilket leder till lågt antal epitelceller. DF har en större volym än PDL och innehåller fler celler. DF kan vara en vävnadskälla för den primära kulturen av mänskliga tandepitetelceller. Det här protokollet är enklare och effektivare än isoleringsmetoden med PDL. Anskaffa mänskliga tandläkare epitelial celler kan underlätta ytterligare studier av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner.
Introduction
Tandbildning börjar med invagination av det orala epitelet1. Enligt tandutvecklingsstadiet har det orala epitelet olika namn, inklusive inre och yttre emalj epitel, livmoderhalscancer slinga och Hertwigs epitelial rothylsa (HERS). Epitelial fack kommunicerar med de omgivande mesenchymala cellerna. Epitelial-mesenkymal interaktioner reglerar tandbildning och vävnad regenerering. Att anskaffa tandläkare epitelial celler, såsom muntliga keratinocyter och Hertwigs epitelial rot slidceller (HERSCs), är avgörande för studien av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner2.
Gnagare-härledda tandepitetelceller isoleras från epitelstrukturen, såsom HERS. Li och kollegor isolerade och odödliggjorda råtta molar-härledda HERSCs efter skörd den apikala delen av de utveckla tand bakterier från 8-dagars gamla råttor3. HERS separerades från apikal vävnad under förstoring. Med tanke på tandutvecklingsstadiet och åldern är det nästan omöjligt att skörda HERS från människor på grund av etiska problem: en utvecklande tandgrodd måste avlägsnas från ett litet barn för att skörda den mänskliga HERS. Omogna tandbakterier extraheras sällan. Mänskliga tandkort epitelceller kan isoleras från tandköttet och parodontala ligament (PDL). Epitelial struktur-härledda celler deltar i tandbildning tillsammans med mesenchymala komponenter och kan vara mer lämplig för studier av tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner än muntliga keratinocyter. Epitelcellsrester av Malassez (ERM) är HERS-härledda epitelrester och finns i ett litet antal i PDL4. Studier rapporterar isolering av mänskliga HERSCs från PDL5. Att skörda mänskliga HERSCs från PDL vävnad är dock inte alltid framgångsrikt på grund av bristen på epitelpopulationen på denna plats5,6.
Även om gnagare-härledda HERSCs upprätthålls i serum-innehållande media3,7, odlas mänskliga DF-härledda epitelceller med serumfria medier som liknar andra mänskliga epitelceller, såsom normala mänskliga epidermal keratinocyter och normala mänskliga muntliga keratinocyter8,9. Detta innebär fysiologiska eller funktionella skillnader mellan gnagare tandläkare epitelial celler och mänskliga tandläkare epitelial celler. Förstå mekanismen när det gäller tandläkare epitelial-mesenchymal interaktioner kan bidra till utvecklingen av kliniska tillämpningar, inklusive parodontala återanslutning under återplantering, parodontala regenerering i parodontala sjukdomar, massa-dentin komplexa regenerering och bio-tand generation. Med tanke på egenskaperna hos translationell forskning, mänskliga tandläkare epitelial celler kan vara lämpligare än gnagare tandläkare epitelial celler för studier av epitelial-mesenchymal interaktioner.
Den mänskliga DF är en lös bindväv och bor ofta i en påverkad tand. DF innehåller mesenkymala prekursorer10. Såvitt vi vet har dock ingen studie rapporterat isolering av epitelceller från tandsäckar före 2021. Oh och Yi rapporterade isoleringen av epitelceller från mänsklig DF 20218. Epitelial fenotyp bekräftades av västra blotting och morfologiska analys. Analys av ursprunget till DF-härledda epitelceller visade liknande resultat med andra studier. DF-härledda epitelial celler var varken endotel eller hematopoietic5,11, och Oh och Yi föreslog att namnge dessa celler som DF-HERSCs. DF har en större volym än PDL, och fler epitelceller kan isoleras från DF. Detta ökar uppkomsten av epitelkolonier och resulterar i en hög framgångsgrad vid skörd av epitelceller från DF. Denna studie föreslår att använda DF som en vävnad källa för isolering av tandläkare epitelial celler.
I den aktuella studien isolerades enstaka celler från DF enligt tidigare beskrivna förfaranden10,12. DF innehåller heterogena cellpopulationer, och flera celltyper kan vara närvarande i det tidiga skedet av förfarandet. Morsczek och kollegor isolerade DF-härledda mesenkymala stamceller10. Vi hypotesen att DF innehåller epitelial celler och att endast epitelial celler kan överleva under serum-fria villkor. Denna studie skiljer sig från Morsczek et al. när det gäller valet av epitelpopulationen och hämningen av mesenkymala celler. Urvalet utfördes med keratinocyt serum-free media (SFM), som tillåter epitelial cell spridning och hämmar mesenchymal cell spridning. Denna studie härstammar från en rapport av Oh och Yi8. Syftet med denna studie var att beskriva detaljer om den metod som används i den rapporten för isolering av epitelceller från mänskliga DF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det här protokollet innehåller kritiska steg. Skörd encelliga populationer är avgörande för framgångsrik isolering av epitelceller från DF. Vi försökte isolera epitelceller från DF baserat på vår hypotes att det finns fler epitelial celler i DF. Malningsproceduren förbättrar lösgöring och frisättning av celler från DF. Malning förfarandet förbättrades, och malet upprepas tills DF uppträdde pulpy att underlätta frisättningen av enskilda celler. Att få det maximala antalet enstaka celler ökar san…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av bidrag från National Research Foundation of Korea (NRF) som finansierades av den koreanska regeringen (NRF-2017R1C1B2008406 och NRF-2021R1F1A1064350). Dr. Hee-Yeon Bae tillhandahöll vänligt DF för primärkultur.
Materials
| EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur 2-Propanol | EMD millipore Co., MA, USA | 1096341011 | 1 L |
| 0.05% trypsin-EDTA | Gibco, Grand island, NY, USA | 25300054 | 100 mL |
| 40 μm cell strainer | Falcon, NC, USA | 352340 | |
| Cell culture dish (100 x 20 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 172958 | Discontinued |
| Cell culture dish (60 x 15 mm) | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 150326 | |
| Collagenase type 1 | Gibco, Grand island, NY, USA | 17100017 | 1 g |
| Combi-514R / Refrigerated large capacity centrifuge | Hanil science industrial Co., LTD., Daejeon, South Korea | CB-514R | |
| Conical tube | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 50015 50050 |
15 mL 50 mL |
| Cryogenic vial | Corning Inc., NY, US | 430488 | 2 mL |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich, Missouri, US | D2650-100ml | 100 mL |
| Dispase | Gibco, Grand island, NY, USA | 17105041 | 1 g |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Welgene Inc., Gyengsangbuk-do, South Korea | LB 001-02 | 500 mL |
| Fetal bovine serum | Gibco, Grand island, NY, USA | 16000044 | 500 mL |
| Heraeus BB 15 / CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 51023121 | |
| Keratinocyte serum-free medium | Gibco, Grand island, NY, USA | 10724-011 | 500 mL |
| MVE CryoSystem 2000 | MVE Biological Solutions Co., GA, USA | CryoSystem 2000 | |
| Nalgene Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 5100-0001 | for 1.2-2 mL CryoVials |
| Olympus CKX41 / Inverted cell culture microscope | Olympus Life Science, Waltham, Massachusetts |
22-00723-01 | Discontinued |
| Penicillin-Streptomycin Strep | Gibco, Grand island, NY, USA | 15140122 | 100 mL (10,000 U/mL) |
| Pipet aid XP | Drummond scientific Co., PA, USA | HDR-4-000-201 | |
| Pipetman Classic P1000 | Gilson, Villiers le Bel, France | F123602 | 100-1000 µL |
| Refrigerant | Nihon freezer Co. Ltd., Tokyo, Japan | CLN 540U | ~-80 °C / Discontinued |
| Serological pipet | SPL Life Sciences Co., Ltd., Gyeonggi-do, South Korea | 91010 | 10ml |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA | 12605010 | cell dissociation protease |
Referências
- Tucker, A., Sharpe, P. The cutting-edge of mammalian development; How the embryo makes teeth. Nature Reviews Genetics. 5 (7), 499-508 (2004).
- Choung, H. W., et al. The effect of CPNE7 on periodontal regeneration. Connective Tissue Research. 60 (5), 419-430 (2019).
- Li, X., et al. Development of immortalized Hertwig’s epithelial root sheath cell lines for cementum and dentin regeneration. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 3 (2019).
- Huang, X. F., Bringas, P., Slavkin, H. C., Chai, Y. Fate of HERS during tooth root development. Biologia do Desenvolvimento. 334 (1), 22-30 (2009).
- Farea, M., et al. Isolation and enhancement of a homogenous in vitro human Hertwig’s epithelial root sheath cell population. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11157-11170 (2013).
- Jung, H. S., et al. Directing the differentiation of human dental follicle cells into cementoblasts and/or osteoblasts by a combination of HERS and pulp cells. Journal of Molecular Histology. 42 (3), 227-235 (2011).
- Fang, J., Tang, L., Liu, X. H., Wen, L. Y., Jin, Y. Changes of the unique odontogenic properties of rat apical bud cells under the developing apical complex microenvironment. International Journal of Oral Science. 1 (1), 26-33 (2009).
- Oh, J. E., Yi, J. K. Isolation and characterization of dental follicle-derived Hertwig’s epithelial root sheath cells. Clinical Oral Investigations. 25 (4), 1787-1796 (2021).
- Oh, J. E., Kim, R. H., Shin, K. H., Park, N. H., Kang, M. K. Delta Np63 alpha protein triggers epithelial-mesenchymal transition and confers stem cell properties in normal human keratinocytes. Journal of Biological Chemistry. 286 (44), 38757-38767 (2011).
- Morsczeck, C., et al. Isolation of precursor cells (PCs) from human dental follicle of wisdom teeth. Matrix Biology. 24 (2), 155-165 (2005).
- Nam, H., et al. Expression profile of the stem cell markers in human Hertwig’s epithelial root sheath/Epithelial rests of Malassez cells. Molecular and Cells. 31 (4), 355-360 (2011).
- Lee, J. H., et al. Dental follicle cells and cementoblasts induce apoptosis of ameloblast-lineage and Hertwig’s epithelial root sheath/epithelial rests of Malassez cells through the Fas-Fas ligand pathway. European Journal of Oral Sciences. 120 (1), 29-37 (2012).
- Wan, A. C. A. Recapitulating cell-cell Interactions for organoid construction – are biomaterials dispensable. Trends in Biotechnology. 34 (9), 711-721 (2016).
- Guo, Y., et al. Are Hertwig’s epithelial root sheath cells necessary for periodontal formation by dental follicle cells. Archives of Oral Biology. 94, 1-9 (2018).
- Sugaya, T., Tomita, M., Motoki, Y., Miyaji, H., Kawamami, M. Influence of enamel matrix derivative on healing of root surfaces after bonding treatment and intentional replantation of vertically fractured roots. Dental Traumatology. 32 (5), 397-401 (2016).
- Fong, H. K., Foster, B. L., Popowics, T. E., Somerman, M. J. The crowning achievement: getting to the root of the problem. Journal of Dental Education. 69 (5), 555-570 (2005).
- Bonczek, O., et al. Tooth agenesis: What do we know and is there a connection to cancer. Clinical Genetics. 99 (4), 493-502 (2021).
