草甘膦产品(GBP)是全球最常见的广谱除草剂。在本文中,我们介绍了量化GBP对微生物组影响的一般指南,从现场实验到生物信息学分析。
草甘膦产品(GBP)是全球最常见的广谱除草剂。草甘膦的靶标是莽草酸途径中的5-烯醇丙酮基敷素-3-磷酸合酶(EPSPS),这在植物中几乎普遍存在。酶的抑制阻止了三种必需氨基酸的产生:苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸。EPSPS也存在于真菌和原核生物中,如古菌和细菌;因此,GBP的使用可能会对土壤,植物,食草动物和次级消费者的微生物组组成产生影响。本文旨在提供一般指南,以评估GBP对微生物组的影响,从现场实验到生物信息学分析,并提供一些可测试的假设。提出了两个现场实验来测试非目标生物体上的GBP。首先,对10个模拟免耕种植的复制对照和GBP处理样地的植物相关微生物进行采样和分析。在第二个实验中,从含有草甘膦残留物的家禽粪便或未经处理的对照粪便施肥的实验样地中获得样品。利用EPSPS蛋白序列的生物信息学分析来确定微生物对草甘膦的潜在敏感性。估计GBP对微生物组影响的第一步是确定它们对靶酶(EPSPS)的潜在敏感性。微生物序列可以从公共存储库或通过PCR扩增获得。然而,在大多数现场研究中,微生物组组成是基于通用DNA标记物(如16S rRNA和内部转录间隔体(ITS))确定的。在这些情况下,对草甘膦的敏感性只能通过使用密切相关物种对EPSPS序列进行概率分析来估计。基于EPSPS酶的生物体对草甘膦潜在敏感性的定量,为进一步研究靶标和非靶标抗性机制的实验提供了一种可靠的方法。
现代农业中大量使用杀虫剂显然是导致生物多样性下降的主要原因1。本文重点介绍草甘膦,因为草甘膦基产品(GBPs)由于其效率和可承受的价格而成为全球使用最广泛的农药2,3。除了在农田中杀死杂草外,GBPs还通常用于造林,城市环境和家庭花园;此外,如果按照制造商的说明使用,它们已被宣布为对非目标生物体无毒。然而,越来越多的近期研究表明,草甘膦及其降解产物的残留物可能保留在土壤中并运输,从而对非目标生物体产生级联作用4,5,6,7,8 。草甘膦的作用不仅限于植物 – 莽草酸途径也存在于许多真菌和原核生物中。草甘膦靶向莽草酸途径中的5-烯醇丙酮基志糖酸-3-磷酸合酶(EPSPS),也称为aroA9。该酶是三种必需芳香氨基酸(苯丙氨酸,酪氨酸和色氨酸)合成中莽草酸途径的中心,并且存在于大多数原核生物,植物和真菌10,11中。一些微生物物种通过几种机制(包括EPSPS序列中的突变)对草甘膦产生了部分或绝对的抗性。因此,有人提出,使用GBPs可能对植物和动物微生物组产生直接影响,包括人类肠道微生物组12,13,14。然而,英镑的使用可能会对依赖微生物和微生物促进过程的几乎任何生态系统功能和服务产生不利影响。随之而来的威胁可能涉及生化土壤过程,授粉生物学以及动物和人类福祉。这需要更全面地了解草甘膦如何影响莽草酸盐途径和方法来评估微生物对草甘膦的敏感性。
在该协议中,我们提出了一个管道来测试草甘膦和GBP对微生物组的影响,从现场实验到生物信息学分析。我们详细描述了最近发表的一种生物信息学方法,可用于确定生物体对草甘膦的潜在敏感性12。据研究人员所知,这是第一个也是迄今为止唯一一个评估EPSPS酶对GBPs活性成分的内在敏感性的生物信息学工具。这种生物信息学方法基于对草甘膦靶酶(EPSPS)12中已知氨基酸标记物的检测。该管道分为五个主要工作阶段(图1):1)简要介绍两个现场实验以测试GBPs的效果,2)微生物组分析(16S rRNA,ITS和 EPSPS 基因)的简要摘要,3)从公共存储库收集EPSPS序列,4)确定生物体对草甘膦的潜在敏感性,以及5)从通用微生物标记物(16S rRNA和ITS)评估EPSPS类。
该协议为如何根据EPSPS蛋白的分析量化GBP对微生物组的影响提供了一般指导。该协议有三个主要的关键步骤:(i)从微生物组数据中定量EPSPS蛋白。这一步至关重要,因为EPSPS是除草剂的直接靶酶。因此,具有 EPSPS 基因拷贝的物种可能会受到使用GBP的影响。然而,即使缺乏 EPSPS 基因拷贝的物种也可能通过替代的非靶机制受到除草剂的影响43,44。(ii)如果 EPSPS 基因的分析不包括在研究的设计中,则可以通过分析16S rRNA(细菌)或 ITS (真菌)来获得良好的估计。在这种情况下,必须依靠全面的参考表(例如,ATGC数据库提供了来自几个密切相关物种的EPSPS蛋白序列)。(iii)EPSPS蛋白根据EPSPS活性位点的某些氨基酸残基分为对草甘膦的潜在敏感性或抗性。然而,影响单个氨基酸的突变可能改变这种分类45 ,并且类之间的转变可能发生在相对较短的时间内14。
生物体对草甘膦的潜在敏感性可以通过参考基因组,氨基酸标记和序列比对来确定。(一) 参考基因组:EPSPS酶可根据氨基酸标记物和基序的存在(在III类的情况下)被分类为对草甘膦具有潜在敏感性(I类[α或β]46,47)或耐药性(II类48,49,III50和IV51)。这些氨基酸标志物和基序基于霍乱弧菌(vcEPSPS,I类)、贝氏柯克斯体(cbEPSPS,II类)、水泡短孢子虫(bvEPSPS,III类)和达瓦氏链霉菌(sdEPSPS,IV类)的EPSPS蛋白中氨基酸残基的位置。(ii)氨基酸标志物:草甘膦与EPSPS酶相互作用并与磷酸烯醇丙酮酸盐(PEP,EPSPS酶的第二底物)竞争52,53。在某些物种中,EPSPS序列中的小氨基酸变化为PEP提供了更高的亲和力和对草甘膦12,14,52,54,55的抗性。在其它序列中,草甘膦在非抑制性构象45中结合EPSPS序列。虽然已经描述了许多抗草甘膦的12,14,48,49,52,54,55和耐受性56,57 EPSP序列,但目前EPSPS的分类系统分为四大类(I-IV)12(表5).(iii)序列比对:为了对EPSPS酶进行分类,我们对每个参考序列(vcEPSPS,cbEPSPS,bvEPSPS和sdEPSPS)的查询序列进行了成对比对,使用多个序列比对程序默认参数35-进行。这些比对对于识别氨基酸标记物在查询序列中的位置是必要的。结果,根据氨基酸标记物的存在和基于III类基序标记物的存在,将酶分类为所述的12类I,II和/或IV。
该协议基于四种已知类型的EPSPS:一种类型是敏感的,另外三种是抵抗的)。然而,原核生物中大约10%的EPSPS序列尚未分类(古菌中为16%,细菌中为8%)12。因此,进一步的研究应分析这些序列以确定草甘膦的敏感性。EPSPSClass 服务器提供了一个测试新遗传标记的选项。EPSPS 的已知类别的标识非常简单,如第 4.4 节所示。和 图 5。此外,在那些用户想要比较自己的查询和参考蛋白的情况下,服务器提供了一个选项,以手动包括一个参考序列和一组氨基酸标记物(图11)。该选项可用于鉴定EPSPS的新类别,以及测试其他除草剂和靶序列。
EPSPS类的分析通过序列分析和氨基酸标志物的存在/不存在来确定。这是一个初步估计,可用于现场的假设检验。氨基酸标志物已在文献中基于经验和观察性研究46,47,48,49,50,51确定。然而,用于确定EPSPS类别的参考蛋白序列仅在有限数量的物种中进行了测试,并且可能偶尔无法解释对草甘膦的耐药性。代偿性突变和EPSPS相关结构域(主要在真菌中)的影响也可能影响对草甘膦58的敏感性。本文的分析基于四个EPSPS类。对人类肠道微生物组中细菌的调查显示,其中约30%是未分类的(即,来自这些物种的EPSPS蛋白不属于任何已知类别),需要进一步的研究来鉴定其他EPSPS类别。此外,应该注意的是,细菌和植物中的EPSPS蛋白序列是unidomain,而真菌EPSPS蛋白含有几个结构域59。因此,真菌中的蛋白质折叠可能导致EPSPS酶对草甘膦的不同反应。此外,不考虑其他非靶机制的抗性(例如,外排泵和EPSPS基因13的过表达)或对草甘膦的敏感性(例如,草甘膦对线粒体转运链12的影响)。
尽管GBPs自1974年以来一直作为除草剂存在,并且自1991年以来一直被广泛使用,但这是第一种确定生物体对草甘膦潜在敏感性的生物信息学方法。该方法基于靶序列中已知氨基酸残基的鉴定。因此,我们的方法提供了草甘膦对物种潜在影响的基线估计。在不久的将来,新的生物信息学方法应包括EPSPS蛋白的其他类别,以确定未分类序列对草甘膦的潜在敏感性12,54,55。此外,鉴于EPSPS酶的确切行为可能因单个氨基酸变化12,14,52,54,55而变化,进一步在计算机实验中应考虑EPSPS蛋白折叠的微小变化,以及EPSPS相关结构域对真菌中蛋白质结构的影响58.此外,已经表明对草甘膦的耐受性可能是通过EPSPS蛋白56,57的过表达产生的;因此,基于改进密码子使用60的生物信息学分析可用于鉴定最大化或最小化基因表达的新型EPSPS序列。
农民、政治家和决策者迫切需要彻底了解与大量使用杀虫剂相关的风险。因此,既有必要使用生物信息学工具揭示生物体对杀虫剂的潜在敏感性,也需要在不同环境中进行复制良好,随机化和现场现实的实验研究。所提出的旨在检查生物体对草甘膦敏感性的生物信息学方法可以调节其他杀虫剂。同样,实验生态学的方法可以应用于研究任何相关的生态问题。总之,这些方法可用于证明现场观察,基因组数据和农药使用之间的伤亡情况。所有介绍的方法在风险评估中都是无价的。例如,生物信息学方法可用于监测微生物对农用化学品的适应性,并提供一种定量方法来测试潜在的其他相关风险,例如病原体对农用化学品的耐药性增加,对综合虫害管理(IPM)中用作生物控制剂的微生物的负面影响,以及细菌中的抗生素耐药性。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由芬兰科学院资助(授予Marjo Helander的311077号)。
2100 Bioanalyzer Instrument | INVITEK Molecular | 1037100300 | Genomic DNA extraction from plant tissues |
dNTP mix (10 mM each) | BIO-RAD | 1852196 | For PCR reactions |
GoTaq G2 DNA Polymerase kit | Promega | M7848 | PCR buffer and DNA Polymerase for PCR amplification |
Invisorb Spin Plant Mini Kit | Agilent | G2939B | To check the concentration and quality of PCR products |
Ion Chip Minifuge | sage science | PIP0001 | For size fractionation of PCR amplicons |
Ion PGM System | ThermoFisher Scientific | 4462921 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Ion PGM Torrent Server | ThermoFisher Scientific | 4483643 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pippinprep | ThermoFisher Scientific | 4479672 | For targeted sequencing of microbial PCR products |
Pressure tank | Berthoud | 102140 | For sprayin glyphosate based products in field |
Primers | ThermoFisher Scientific | R0192 | For PCR amplification |
Rotary tiller | Grillo | 984511 | For tilling the soil in experimental plots |
S1000 ThermalCycler | Sigma-Aldrich | Custom-made | For PCR amplification |