Колонки клеточной мембранной аффинности хроматографии для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с иммобилизованным рецептором тропомиозинкиназы B

Summary

Протокол описывает получение колонок клеточной мембранно-аффинной хроматографии (CMAC) с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны, содержащими функциональные трансмембранные тропомиозинкиназные рецепторы В-белки. Также объясняется использование колонок CMAC для идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с этими рецепторами и присутствующих в сложных природных смесях.

Abstract

Химические вещества, синтезируемые растениями, грибами, бактериями и морскими беспозвоночными, были богатым источником новых лекарственных средств и свинец. Лекарства, такие как статины, пенициллин, паклитаксел, рапамицин или артемизинин, обычно используемые в медицинской практике, были впервые идентифицированы и выделены из натуральных продуктов. Однако идентификация и выделение биологически активных специализированных метаболитов из природных источников является сложным и трудоемким процессом. Традиционно отдельные метаболиты выделяют и очищают от сложных смесей после экстракции биомассы. Впоследствии выделенные молекулы тестируются в функциональных анализах для проверки их биологической активности. Здесь мы представляем использование колонок клеточной мембранной аффинной хроматографии (CMAC) для идентификации биологически активных соединений непосредственно из сложных смесей. Колонки CMAC позволяют идентифицировать соединения, взаимодействующие с иммобилизованными функциональными трансмембранными белками (TMP), встроенными в их нативную фосфолипидную двухслойную среду. Это целенаправленный подход, который требует знания TMP, активность которого предполагается модулировать с недавно идентифицированным кандидатом на низкомолекулярное лекарство. В этом протоколе мы представляем подход к подготовке колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы. В этой статье мы предоставляем подробный протокол для сборки колонки CMAC с иммобилизованными рецепторами TrkB с использованием клеточных линий нейробластомы, чрезмерно экспрессирующих рецепторы TrkB. Далее представлен подход к исследованию функциональности колонки и ее использование при идентификации специализированных растительных метаболитов, взаимодействующих с рецепторами TrkB.

Introduction

Ботанические смеси богаты фармакологически активными соединениями¹, служащими хорошим источником для идентификации новых лекарственных хитов и свинец ^2,3,4,5. Открытие новых лекарств из натуральных продуктов было плодотворным подходом, и многие одобренные в настоящее время лекарства произошли из соединений, впервые идентифицированных в природе. Химическое разнообразие природных соединений трудно сопоставить с искусственными библиотеками химически синтезированных молекул. Многие природные соединения взаимодействуют и модулируют мишени человеческого белка и могут считаться эволюционно оптимизированными лекарственными молекулами⁶. Эти природные соединения особенно хорошо подходят для идентификации лекарственного свинца для использования при неврологических расстройствах⁶. Два из одобренных в настоящее время FDA препаратов для лечения болезни Альцгеймера (БА) получены из природных алкалоидов, а именно: галантамин и ривастигмин (производное физостигмина)⁶. L-DOPA, в настоящее время наиболее часто назначаемый препарат при болезни Паркинсона, был впервые идентифицирован из широкой фасоли (Vicia faba L.) ⁷. Перголид и лизурид, агонисты дофаминергических рецепторов являются производными природных алкалоидов спорыньи из паразитического гриба Claviceps purpurea⁸. Резерпин, алкалоид, выделенный из индийского змеиного корня (Rauvolfia serpentina (L.) Benth. ex Kurz), был одним из первых антипсихотических препаратов⁹. В последнее время дисрегулируемый иммунный ответ и системное воспаление были связаны с развитием многочисленных неврологических заболеваний, таких как большое депрессивное расстройство или нейродегенеративные заболевания¹⁰. Было обнаружено, что растительная диета вместе с другими вмешательствами в образ жизни улучшает когнитивные и функциональные способности у пожилых людей ^{11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21} . Было обнаружено, что некоторые электрофильные молекулы, принадлежащие тритерпенам и полифенолам, модулируют воспалительные реакции как в моделях in vitro, так и in vivo ¹². Например, природные соединения, содержащие α β-ненасыщенного карбона (например, куркумин, циннамальдегид) или изотиоцианатную группу (например, сульфорафан), препятствуют димеризации Toll-подобного рецептора-4 (TLR4), ингибируя последующий синтез провоспалительных цитокинов в мышиной интерлейкин-3-зависимой про-В клеточной линии^12,22 . Эпидемиологические данные убедительно указывают на то, что диетические фитохимические вещества, присутствующие в сложных пищевых матрицах, также могут представлять собой жизнеспособный источник новых лекарственных проводов⁶.

Одним из основных препятствий в идентификации биологически активных молекул, присутствующих в растительных экстрактах, включая растительную пищу, является сложность исследуемых образцов. Традиционно отдельные соединения выделяют, очищают и впоследствии проверяют на биологическую активность. Такой подход обычно приводит к выявлению наиболее распространенных и хорошо охарактеризованных соединений. Подходы к открытию фенотипических лекарств без определенной молекулярной мишени основаны на био-управляемом фракционировании сложных смесей²³. При таком подходе экстракт фракционируется на менее сложные субфракции, которые впоследствии тестируются в фенотипических анализах. Выделение и очистка активных соединений определяются биологической активностью, проверенной в анализе. Знание идентичности указанной лекарственной мишени может значительно ускорить идентификацию фармакологически активных соединений, присутствующих в сложных смесях. Эти подходы обычно основаны на иммобилизации молекулярной мишени, например, фермента, на твердой поверхности, такой как магнитные шарики²³. Иммобилизованные мишени впоследствии используются в скрининговых экспериментах, что приводит к выделению соединений, взаимодействующих с мишенью. Хотя этот подход широко использовался при идентификации соединений, нацеленных на цитозольные белки, он реже применялся при идентификации химических веществ, взаимодействующих с трансмембранными белками (TMP)²³. Дополнительная проблема в иммобилизации TMP связана с тем, что активность белка зависит от его взаимодействия с фосфолипидами клеточной мембраны и другими молекулами в бислое, такими как холестерин^23,24. Важно сохранить эти тонкие взаимодействия между белками и их нативной фосфолипидной двухслойной средой при попытке обездвижить трансмембранную мишень.

При сродстве клеточной мембраны (CMAC) фрагменты клеточной мембраны, а не очищенные белки, иммобилизуются на искусственной мембране (IAM) частиц стационарной фазы²³. Стационарные фазы IAM получают путем ковалентного связывания аналогов фосфатидилхолина с кремнеземом. В последнее время были разработаны новые классы стационарных фаз IAM, в которых свободные аминные и силаноловые группы являются концевыми (IAM. ПК. Частицы DD2). При подготовке колонок CMAC фрагменты клеточной мембраны иммобилизуются на поверхность частиц IAM путем адсорбции.

Колонки CMAC до настоящего времени использовались для иммобилизации различных классов TMP, включая ионные каналы (например, никотиновые рецепторы), GPCR (например, опиоидные рецепторы), переносчики белка (например, p-гликопротеин) и ^т.д.24. Иммобилизованные белковые мишени были использованы для характеристики фармакодинамики (например, константа диссоциации, Kd) или определения кинетики связывания (k_on и k_off) лигандов малых молекул, взаимодействующих с мишенью, а также в процессе идентификации потенциальных новых лекарственных проводов, присутствующих в комплексных матрицах²⁴ . Здесь мы представляем подготовку колонок CMAC с иммобилизованным тропомиозинкиназным рецептором B (TrkB), который стал жизнеспособной мишенью для открытия лекарств для многочисленных расстройств нервной системы.

Предыдущие исследования показали, что активация нейротрофического фактора мозга (BDNF) / пути TrkB связана с улучшением некоторых неврологических заболеваний, таких как AD или большое депрессивное расстройство 25,26,27,28. Сообщалось, что уровни BDNF и экспрессия TrkB рецептора TrkB снижаются при AD, и аналогичные снижения ухудшают функцию гиппокампа на животных моделях AD²⁹. Снижение уровня BDNF было зарегистрировано в сыворотке крови и головном мозге пациентов с БА 30,31,32. Было обнаружено, что сверхэкспрессия тау или гиперфосфорилирование снижают экспрессию BDNF в первичных нейронах и животных моделях AD 33,34,35. Кроме того, сообщалось, что BDNF оказывает защитное воздействие на нейротоксичность in vitro и in vivo³⁶, индуцированную β-амилоидом. Было показано, что прямое введение BDNF в мозг крысы улучшает обучение и память у животных с когнитивными нарушениями³⁷. BDNF / TrkB стал действительной мишенью для улучшения неврологических и психических расстройств, включая^{AD 28,38}. Нацеливание на сигнальный путь BDNF / TrkB для разработки методов лечения при БА потенциально улучшит наше понимание заболевания³⁹. К сожалению, сам BDNF не может быть использован в качестве лечения из-за его плохих фармакокинетических свойств и неблагоприятных побочных эффектов⁴⁰. Низкомолекулярные активаторы путей TrkB/BDNF были исследованы в качестве потенциальных лигандов TrkB 41,42,43. Среди протестированных агонистов малых молекул было показано, что 7,8-дигидроксифлавон (7,8-DHF) активирует путь BDNF / TrkB 41,44,45,46. Производное 7,8-DHF (R13; 4-Oxo-2-фенил-4H-хромен-7,8-диил-бис(метилкарбамат)) в настоящее время рассматривается в качестве возможного лекарственного средства для AD⁴⁷. Недавно было показано, что несколько антидепрессантов работают через прямое связывание с TrkB и содействие передаче сигналов BDNF, что еще больше подчеркивает важность использования TrkB в качестве действительной цели для лечения различных неврологических расстройств⁴⁸.

Протокол описывает процесс сборки функциональной колонки TrkB и отрицательной управляющей колонки TrkB-NULL. Колонки характеризуются использованием известного натурального продукта мелкомолекулярного лиганда: 7,8-DHF. Дополнительно описан процесс скрининга сложных матриц, используя в качестве примера растительный экстракт, для идентификации соединений, взаимодействующих с TrkB.

Protocol

1. Клеточная культура клеток нейробластомы SH-SY5Y (клеточные линии TrkB и TrkB-NULL (родительские)) ПРИМЕЧАНИЕ: Сотовые линии (SH-SY5Y Cell Line (TrkB, BR6) и SH-SY5Y Родительская клеточная линия (TrkB NULL))49,50 были приобретены у Kerafast. Культивируемые клетки испол…

Representative Results

В соответствии с протоколом были собраны две хроматографические колонки CMAC: одна с иммобилизованными фрагментами клеточной мембраны нейробластомы SH-SY5Y с гиперэкспрессированным TrkB и одна с фрагментами клеточной мембраны SH-SY5Y TrkB-NULL. Правильно собранная колонна CMAC представлена <strong class="…

Discussion

Идентификация активных соединений, присутствующих в сложных смесях специализированных метаболитов, является очень сложной задачей²³. Традиционно выделяют отдельные соединения, а их активность тестируют в разных анализах. Такой подход является трудоемким и дорогостоящим…

Materials

7-8 Dihydroxyflavone hydrate	Sigma-Aldrich	D5446-10 mg	≥98% (HPLC)
Adenosine 5'-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A2383-1 g
Ammonium acetate	VWR Chemicals BDH	BDH9204-500 g
BDNF antibody	Invitrogen	PA5-15198-400 μL	Primary antibody; 2 mg/mL of concentration
Benzamidine hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	B6506-25 g
Brain derived neurotrophic factor (BDNF) human	Sigma-Aldrich	B3795-10 μg	Recombinant, expressed in E. coli, lyophilized powder, suitable for cell culture
Calcium chloride	VWR Analytical	BDH9224-1 kg
Cholic acid sodium salt	Alfa Aesar	J62050-100 g
Dounce homogenizer	VWR	71000-516	40 mL, 285 mm (overall lenght), 32 x 140 mm (O.D. x H)
Ethanol	Sigma-Aldrich	493511
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR Analytical	BDH-9232-500 g
Fetal bovine serum	Sigma-Aldrich	F2442-500 mL	sterile-filtered, suitable for cell culture
G418 disulfate salt solution	Sigma-Aldrich	G8168-100 mL	50 mg/mL in H2O, 0.1 μm filtered, suitable for cell culture
Glycerol	VWR Life Science	E520-100 mL
Immobilized artificial membrane (IAM.PC.DD2)	Regis Technologies, Inc.	1-771050-500
Magnesium chloride hexahydrate	VWR Analytical	BDH9244-500 mL
Methanol	Sigma-Aldrich	322425
Nikon Plan Fluor	Nikon		Confocal laser scanning microscope
Normal goat serum (10%)	Life Technologies	50197Z
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100 mL
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)	Thermo Scientific	36978-5 g
Phosphate buffered saline (PBS)	VWR Life Science	K812-500 mL	1x
Potassium chloride	VWR Chemicals BDH	0395-1 kg
Protease inhibitor cocktail	VWR Life Science Ambreso	M221-1 mL	Proteomics grade, containing 50 mM AEBSF, 30 µM aprotonin, 1 mM bestatin, 1 mM E-64 and 1 mM leupeptin
RPMI-1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758-500 mL	with L-glutamine and sodium bicarbonate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Secondary antibody goat anti-rabbit IgG (H+L)	Invitrogen Alexa Flour Plus 488	A32731
SH-SY5Y Neuroblastoma cell lines expressing Trk-B	Kerafast	ECP007
SH-SY5Y Trk-NULL cell line	Kerafast	ECP005
Snake skin dialysis tubing	Thermo Scientific	88245	10K MWCO, 35 mm dry I.D.
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	BDH VWR Analytical	BDH9286-2.5 kg
Tricorn 5/20 column	GE Healthcare	24-4064-08
Tris-HCl	VWR Life Science	0497-1 kg
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T4049-500 mL	0.25%, sterile-filtered, suitable for cell culture, 2.5 g porcine trypsin and 0.2 g EDTA