Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu
Summary
Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.
Abstract
Yeni nesil dizilemedeki son gelişmeler, araştırmacıların moleküler ve hücresel biyoloji hakkındaki bilgilerini ilerletmekte olup, vasküler biyolojide yeni paradigmaları ortaya koyan çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bu yöntemlerin vasküler gelişim modellerine uygulanması, embriyonik ve postnatal dokulardan hücre izolasyon tekniklerinin optimizasyonunu gerektirir. Hücre verimi, canlılığı ve saflığı, yeni nesil dizileme yaklaşımlarından doğru ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için maksimum olmalıdır. Yenidoğan faresi retinal vaskülarizasyon modeli, araştırmacılar tarafından vasküler gelişim mekanizmalarını incelemek için kullanılır. Araştırmacılar bu modeli, kan damarı oluşumu ve olgunlaşması sırasında anjiyogenez mekanizmalarını ve arteriyel-venöz kader spesifikasyonunu araştırmak için kullandılar. Retinal vasküler gelişim modelini incelemek için yeni nesil dizileme tekniklerinin uygulanması, retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için hücre verimini, canlılığını ve saflığını en üst düzeye çıkaran bir yöntemin optimizasyonunu gerektirir. Bu protokol, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak murin retinal doku izolasyonu, sindirim ve saflaştırma için bir yöntemi açıklar. Sonuçlar, FACS-saflaştırılmış CD31 + / CD45- endotel hücre popülasyonunun endotel hücre gen ekspresyonu için oldukça zenginleştirildiğini ve FACS’tan sonra 60 dakika boyunca canlılıkta bir değişiklik göstermediğini göstermektedir. Bu yöntem kullanılarak izole edilen endotel hücreleri üzerinde, toplu RNA dizilimi ve tek hücreli RNA dizilimi de dahil olmak üzere, yeni nesil dizileme yaklaşımlarının temsili sonuçları, retinal endotel hücre izolasyonu için bu yöntemin yeni nesil dizileme uygulamalarıyla uyumlu olduğunu göstermektedir. Bu retinal endotel hücre izolasyonu yöntemi, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını ortaya çıkarmak için ileri dizileme tekniklerine izin verecektir.
Introduction
Nükleik asitlerin yeni nesil dizileme yaklaşımlarıyla dizilenmesinin yüksek verim kapasitesi, araştırmacıların moleküler ve hücresel biyoloji hakkındaki bilgilerini büyük ölçüde geliştirmiştir. Bu ileri teknikler arasında tüm transkriptom RNA dizilimi, Tek Nükleotid Polimorfizmlerini (SNP’ler) tanımlamak için hedeflenen bölgelerin DNA dizilimi, Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) dizilemesinde bağlı transkripsiyon faktörlerinin DNA dizilimi veya Transpozaz Erişilebilir Kromatin (ATAC) dizilimi için Tahlilde açık kromatin bölgeleri ve tek hücreli RNA dizilimi1 . Vasküler biyolojide, bu ilerlemeler, araştırmacıların karmaşık gelişim ve hastalık mekanizmalarını aydınlatmalarına ve değişen fenotiplerin 2,3’ünün bir sürekliliği boyunca gen ekspresyon kalıplarını ayırt etmelerine izin vermiştir. Gelecekteki deneyler, yeni nesil dizilemeyi değerlendirilmiş vasküler gelişim modelleriyle birleştirerek karmaşık mekanizmaları daha da tanımlayabilir, ancak numune hazırlama yöntemlerinin gelişmiş dizileme teknikleriyle uyumlu olması gerekir.
Yeni nesil dizileme yaklaşımlarının kalitesi, doğruluğu ve tekrarlanabilirliği, numune hazırlama yöntemine bağlıdır. Hücrelerin bir alt kümesini izole ederken veya dokulardan tek hücreli süspansiyonlar oluştururken, hücre sayısını, canlılığını ve hücre popülasyonunun saflığını en üst düzeye çıkarmak için optimal sindirim ve saflaştırma yöntemleri gereklidir 4,5. Bu, sindirim yönteminde bir denge gerektirir: hücreleri dokudan serbest bırakmak ve aşağı akış yaklaşımları için yeterli hücre elde etmek için güçlü sindirim gereklidir, ancak sindirim çok güçlüyse hücre canlılığı olumsuz yönde etkilenecektir 6,7. Ek olarak, hücre popülasyonunun saflığı, FACS aracılığıyla gerçekleştirilebilecek sağlam sonuçlar ve verilerin doğru analizi için gereklidir. Bu, yerleşik vasküler gelişim modellerine yeni nesil dizileme uygulamak için hücre izolasyon yöntemlerini optimize etmenin önemini vurgulamaktadır.
Vasküler gelişimi araştırmak için iyi karakterize edilmiş bir model murin retinal vasküler gelişim modelidir. Murin retinal vaskülatür, postnatal günde (P)3 görülebilen optik sinirden ilk anjiyojenik filizlenme, sap ve uç hücreleri ile anjiyojenik ön ve P6’da görülebilen ilk damar olgunlaşması ve P9 8,9’dan sonra görülebilen vasküler pleksus olgunlaşması ile postnatal olarak iki boyutlu yüzeysel pleksusta gelişir. İlk vasküler pleksusun yeniden şekillendirilmesi sırasında, endotel hücreleri, dolaşım ağı10,11 oluşturmak için farklı damarlardaki arteriyel, kılcal ve venöz fenotiplere doğru spesifikasyona tabi tutulur. Bu nedenle, bu yöntem araştırmacıların anjiyojenik vasküler pleksus oluşumunu ve endotelyal arteriyel-venöz spesifikasyonu ve olgunlaşmayı gelişim sırasında çeşitli zaman noktalarında görselleştirmelerini sağlar9. Ek olarak, bu model transgenik manipülasyonun anjiyogenez ve vasküler pleksus gelişimi üzerindeki etkilerini araştırmak için vasküler gelişim, arteriyel-venöz malformasyonlar ve oksijene bağlı neovaskülarizasyonun araştırılması için uygulanan bir yöntem sunmaktadır 12,13,14,15,16 . Yeni nesil dizileme yaklaşımlarını murin retinal vasküler gelişim modeli ile birleştirmek için, endotel hücrelerinin retina dokusundan izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol gereklidir.
Bu protokol, hücre verimini, saflığını ve canlılığını en üst düzeye çıkarmak için P6’daki farelerden retina dokusunu sindirmek için optimize edilmiş bir yöntemi açıklar. Retina dokusu P6 farelerden izole edilir, 20 dakika boyunca sindirilir, CD31 ve CD45 için immünoboyalıdır ve endotel hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonunu yaklaşık 2.5 saatte izole etmek için FACS ile saflaştırılır (Şekil 1A). Bu endotel hücrelerinin, izolasyon sonrası60 dakika boyunca yüksek canlılığı koruduğu bulundu 17 ve yeni nesil dizileme yöntemleri için kütüphane hazırlıklarına izin verdi. Ek olarak, bu izolasyon protokolünü kullanan iki ayrı yeni nesil dizileme yönteminden FACS geçit ve kalite kontrol sonuçları için temsili sonuçlar sağlanmaktadır: tüm transkriptom RNA dizilimi ve tek hücreli RNA dizilimi. Bu yöntem, vasküler gelişimin yeni mekanizmalarını aydınlatmak için retinal vaskülarizasyon modeli ile birlikte yeni nesil dizileme yaklaşımlarının kullanılmasına izin verir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, endotel hücrelerinin doğum sonrası murin retina dokusundan izole edilmesi için yüksek hücre sayısı, saflık ve canlılık için optimize edilmiş bir yöntemi açıklamaktadır. Hücre saflığı, endotel hücre popülasyonlarının CD31+/CD45- immün boyama ile sindirilmiş tek hücreli süspansiyondan FACS izolasyonu ile elde edilir. İzolasyon kalitesi, CD31, CD45 ve VE-Cadherin için qPCR ile Trypan mavi boyama ve gen ekspresyonu ile canlılık testlerinde ölçülür (VE-Cadherin immün boyama i…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yale Akış Sitometri Tesisi, Virginia Üniversitesi Akış Sitometrisi Çekirdek Tesisi, Yale Genomik Analiz Merkezi ve Virginia Üniversitesi Genom Analizi ve Teknoloji Çekirdeği’ne, sunulan deneylere katkıda bulunma konusundaki çabaları, uzmanlıkları ve tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma, N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) ve K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) için NIH hibeleri ile finanse edilmiştir.
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
Referências
- Slatko, B. E., Gardner, A. F., Ausubel, F. M. Overview of next-generation sequencing technologies. Current Protocols in Molecular Biology. 122 (1), 59 (2018).
- Chavkin, N. W., Hirschi, K. K. Single cell analysis in vascular biology. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 42 (2020).
- Ma, F., Hernandez, G. E., Romay, M., Iruela-Arispe, M. L. Single-cell RNA sequencing to study vascular diversity and function. Current Opinion in Hematology. 28 (3), 221-229 (2021).
- Potter, A. S., Potter, S. S., S, Dissociation of tissues for single-cell analysis. Methods in Molecular Biology. 1926, 55-62 (2019).
- Braga, F. A. V., Miragaia, R. J. Tissue handling and dissociation for single-cell RNA-seq. Single Cell Methods: Methods in Molecular Biology. 1979, 9-21 (2019).
- Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociatin-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665 (2019).
- Connolly, S., Hores, T., Smith, L., D’Amore, P. Characterization of vascular development in the mouse retina. Microvascular Research. 36 (3), 275-290 (1988).
- Crist, A., Young, C., Meadows, S. Characterization of arteriovenous identity in the developing neonate mouse retina. Gene Expression Patterns: GEP. 23-24, 22-31 (2017).
- dela Paz, N. G., D’Amore, P. A. Arterial versus venous endothelial cells. Cell and Tissue Research. 335 (1), 5-16 (2009).
- Fang, J. S., Hirschi, K. K. Molecular regulation of arteriovenous endothelial cell specification. F1000Res. 8, (2019).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 35 (1), 101-111 (1994).
- Pitulescu, M. E., Schmidt, I., Benedito, R., Adams, R. H. Inducible gene targeting in the neonatal vasculature and analysis of retinal angiogenesis in mice. Nature Protocols. 5 (9), 1518-1534 (2010).
- Ruiz, S., et al. A mouse model of hereditary hemorrhagic telangiectasia generated by transmammary-delivered immunoblocking of BMP9 and BMP10. Scientific Reports. 6, 37366 (2016).
- Fang, J. S., et al. Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification. Nature Communication. 8 (1), 2149 (2017).
- Ola, R., et al. SMAD4 prevents flow induced arterial-venous malformations by inhibiting Casein Kinase 2. Circulation. 138 (21), 2379-2394 (2018).
- Chavkin, N. W., Walsh, K., Hirschi, K. K. Isolation of highly purified and viable retinal endothelial cells. Journal of Vascular Research. 58 (1), 49-57 (2020).
- Hulspas, R., O’Gorman, M. R. G., Wood, B. L., Gratama, J. W., Sutherland, D. R. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry PartB: Clinical Cytometry. 76 (6), 355-364 (2009).
- Bachman, J. Reverse-transcription PCR (RT-PCR). Methods in Enzymology. 530, 67-74 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. Quantification of RNA by real-time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). Cold Spring Harbour Protocols. 2018 (10), (2018).
- Liu, L., Shi, G. P. CD31: beyond a marker for endothelial cells. Cardiovascular Research. 94 (1), 3-5 (2012).
- Zarkada, G., et al. Specialized endothelial tip cells guide neuroretina vascularization and blood-retina-barrier formation. Developmental Cell. 56 (15), 2237-2251 (2021).
- Su, X., Sorenson, C. M., Sheibani, N. Isolation and characterization of murine retinal endothelial cells. Molecular Vision. 9, 171-178 (2003).
- Benedito, R., et al. The notch ligands Dll4 and Jagged1 have opposing effects on angiogenesis. Cell. 137 (6), 1124-1135 (2009).
- Daneman, R., et al. Wnt/beta-catenin signaling is required for CNS, but not non-CNS, angiogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (2), 641-646 (2009).
- Okabe, K., et al. Neurons limit angiogenesis by titrating VEGF in retina. Cell. 159 (3), 584-596 (2014).
- Crist, A. M., Lee, A. R., Patel, N. R., Westhoff, D. E., Meadows, S. M. Vascular deficiency of Smad4 causes arteriovenous malformations: a mouse model of Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia. Angiogenesis. 21 (2), 363-380 (2018).
- Kim, Y. H., Choe, S. W., Chae, M. Y., Hong, S., Oh, S. P. SMAD4 deficiency leads to development of arteriovenous malformations in neonatal and adult mice. Journal of the American Heart Association. 7 (21), 009514 (2018).
- Ma, W., et al. Absence of TGFbeta signaling in retinal microglia induces retinal degeneration and exacerbates choroidal neovascularization. eLife. 8, 42049 (2019).
- Luo, W., et al. Arterialization requires the timely suppression of cell growth. Nature. 589 (7842), 437-441 (2021).
- Lawson, N. D., Vogel, A. M., Weinstein, B. M. sonic hedgehog and vascular endothelial growth factor act upstream of the Notch pathway during arterial endothelial differentiation. Developmental Cell. 3 (1), 127-136 (2002).
- Larrivee, B., et al. ALK1 signaling inhibits angiogenesis by cooperating with the Notch pathway. Developmental Cell. 22 (3), 489-500 (2012).
- Wythe, J. D., et al. ETS factors regulate Vegf-dependent arterial specification. Developmental Cell. 26 (1), 45-58 (2013).
- Davis, D. M., Purvis, J. E. Computational analysis of signaling patterns in single cells. Seminars in Cell and Developmental Biology. , 35-43 (2015).
- Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining signaling pathways with an expanding single-cell toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
- Aibar, S., et al. SCENIC: single-cell regulatory network inference and clustering. Nature Methods. 14 (11), 1083-1086 (2017).
- Trapnell, C., et al. The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by pseudotemporal ordering of single cells. Nature Biotechnology. 32 (4), 381-386 (2014).
