Isolierung von retinen retinalen Endothelzellen für die Sequenzierung der nächsten Generation
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von murinen postnatalen retinalen Endothelzellen, die für Zellertrag, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert sind. Diese Zellen eignen sich für Next-Generation-Sequenzierungsansätze.
Abstract
Jüngste Verbesserungen in der Next-Generation-Sequenzierung haben das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erweitert, wobei mehrere Studien neue Paradigmen in der vaskulären Biologie aufdecken. Die Anwendung dieser Methoden auf Modelle der vaskulären Entwicklung erfordert die Optimierung von Zellisolierungstechniken aus embryonalen und postnatalen Geweben. Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit müssen alle maximal sein, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse aus Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation zu erhalten. Das retinale Vaskularisationsmodell der neonatalen Maus wird von Forschern verwendet, um Mechanismen der vaskulären Entwicklung zu untersuchen. Forscher haben dieses Modell verwendet, um Mechanismen der Angiogenese und der arteriell-venösen Schicksalsspezifikation während der Blutgefäßbildung und -reifung zu untersuchen. Die Anwendung von Next-Generation-Sequenzierungstechniken zur Untersuchung des retinalen vaskulären Entwicklungsmodells erfordert die Optimierung einer Methode zur Isolierung von retinalen Endothelzellen, die die Zellausbeute, Lebensfähigkeit und Reinheit maximiert. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung, Verdauung und Reinigung von retinem retinalem Gewebe unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die FACS-gereinigte CD31+/CD45-Endothelzellpopulation für die Genexpression von Endothelzellen stark angereichert ist und keine Veränderung der Lebensfähigkeit für 60 Minuten nach FACS aufweist. Enthalten sind repräsentative Ergebnisse von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen an Endothelzellen, die mit dieser Methode isoliert wurden, einschließlich Bulk-RNA-Sequenzierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung, die zeigen, dass diese Methode zur retinalen Endothelzellisolierung mit Next-Generation-Sequenzierungsanwendungen kompatibel ist. Diese Methode der retinalen Endothelzellisolierung wird fortschrittliche Sequenzierungstechniken ermöglichen, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzudecken.
Introduction
Die hohe Durchsatzkapazität der Sequenzierung von Nukleinsäuren über Next-Generation-Sequencing-Ansätze hat das Wissen der Forscher über Molekular- und Zellbiologie erheblich erweitert. Diese fortschrittlichen Techniken umfassen die Sequenzierung der gesamten Transkriptom-RNA, die DNA-Sequenzierung von Zielregionen zur Identifizierung von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), die DNA-Sequenzierung gebundener Transkriptionsfaktoren bei der Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)-Sequenzierung oder offene Chromatinregionen in der ATAC-Sequenzierung (Assay for Transposase-Accessible Chromatin) und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung1 . In der Gefäßbiologie haben diese Fortschritte es den Forschern ermöglicht, komplizierte Mechanismen der Entwicklung und Krankheit aufzuklären und Genexpressionsmuster entlang eines Kontinuums unterschiedlicher Phänotypen zu unterscheiden 2,3. Zukünftige Experimente können komplexe Mechanismen weiter definieren, indem sie die Sequenzierung der nächsten Generation mit evaluierten Modellen der vaskulären Entwicklung kombinieren, aber die Methoden zur Probenvorbereitung müssen mit den fortschrittlichen Sequenzierungstechniken kompatibel sein.
Die Qualität, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit von Next-Generation-Sequenzierungsansätzen hängt von der Methode der Probenvorbereitung ab. Bei der Isolierung einer Untergruppe von Zellen oder der Erzeugung einzelliger Suspensionen aus Geweben sind optimale Verdauungs- und Reinigungsmethoden unerlässlich, um die Zellzahl, Lebensfähigkeit und Reinheit der Zellpopulation zu maximieren 4,5. Dies erfordert ein Gleichgewicht in der Verdauungsmethode: Eine starke Verdauung ist notwendig, um Zellen aus dem Gewebe zu befreien und genügend Zellen für nachgeschaltete Ansätze zu erhalten, aber die Zelllebensfähigkeit wird negativ beeinflusst, wenn die Verdauung zu stark ist 6,7. Darüber hinaus ist die Reinheit der Zellpopulation für robuste Ergebnisse und eine genaue Analyse der Daten erforderlich, die durch FACS erreicht werden kann. Dies unterstreicht die Bedeutung der Optimierung von Zellisolationsmethoden, um die Next-Generation-Sequenzierung auf etablierte Modelle der vaskulären Entwicklung anzuwenden.
Ein gut charakterisiertes Modell zur Untersuchung der vaskulären Entwicklung ist das murine retinale vaskuläre Entwicklungsmodell. Das murine retinale Gefäßsystem entwickelt sich postnatal in einem zweidimensionalen oberflächlichen Plexus mit anfänglichem angiogenem Sprießen aus dem Sehnerv, sichtbar am postnatalen Tag (P)3, angiogener Front mit Stiel- und Spitzenzellen und anfänglicher Gefäßreifung sichtbar bei P6 und Reifung des vaskulären Plexus sichtbar nach P9 8,9. Während des Umbaus des anfänglichen vaskulären Plexus werden Endothelzellen in verschiedenen Gefäßen in Richtung arterieller, kapillarer und venöser Phänotypen spezifiziert, um ein Kreislaufnetzwerkzu erzeugen 10,11. Daher ermöglicht diese Methode den Forschern, die angiogene Gefäßplexusbildung und die endotheliale arteriell-venöse Spezifikation und Reifung zu verschiedenen Zeitpunkten während der Entwicklung sichtbar zu machen9. Darüber hinaus bietet dieses Modell eine Methode zur Untersuchung der Auswirkungen transgener Manipulation auf die Angiogenese und die Entwicklung des vaskulären Plexus, die zur Untersuchung von Gefäßentwicklung, arteriell-venösen Fehlbildungen und sauerstoffinduzierter Neovaskularisation eingesetzt wurde 12,13,14,15,16 . Um Next-Generation-Sequenzierungsansätze mit dem murinen retinalen vaskulären Entwicklungsmodell zu kombinieren, ist ein optimiertes Protokoll für die Isolierung von Endothelzellen aus Netzhautgewebe notwendig.
Dieses Protokoll beschreibt eine optimierte Methode zur Verdauung von Netzhautgewebe von Mäusen bei P6, um die Zellausbeute, Reinheit und Lebensfähigkeit zu maximieren. Netzhautgewebe wird aus P6-Mäusen isoliert, für 20 min verdaut, für CD31 und CD45 immungefärbt und durch FACS gereinigt, um eine Einzelzellsuspension von Endothelzellen in etwa 2,5 h zu isolieren (Abbildung 1A). Es wurde festgestellt, dass diese Endothelzellen 60 Minuten nach der Isolierung eine hohe Lebensfähigkeit aufrechterhalten17, was Bibliothekspräparate für Sequenzierungsmethoden der nächsten Generation ermöglicht. Darüber hinaus werden repräsentative Ergebnisse für FACS-Gating- und Qualitätskontrollergebnisse aus zwei separaten Next-Generation-Sequenzierungsmethoden unter Verwendung dieses Isolationsprotokolls bereitgestellt: die gesamte Transkriptom-RNA-Sequenzierung und die Einzelzell-RNA-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht es, Next-Generation-Sequenzierungsansätze in Verbindung mit dem retinalen Vaskularisationsmodell zu verwenden, um neue Mechanismen der vaskulären Entwicklung aufzuklären.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung von Endothelzellen aus postnatalem murinem Netzhautgewebe, die für eine hohe Zellzahl, Reinheit und Lebensfähigkeit optimiert wurde. Die Zellreinheit wird durch FACS-Isolierung von Endothelzellpopulationen aus der verdauten Einzelzellsuspension durch CD31+/CD45-Immunfärbung erreicht. Die Qualität der Isolierung wird in Assays auf Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung und Genexpression mittels qPCR für CD31, CD45 und VE-Cadherin quantifiziert (obwohl VE-Cad…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vielen Dank an die Yale Flow Cytometry Facility, die University of Virginia Flow Cytometry Core Facility, das Yale Center for Genomic Analysis und den University of Virginia Genome Analysis and Technology Core für ihre Bemühungen, ihr Fachwissen und ihre Beratung bei der Durchführung der vorgestellten Experimente. Diese Studie wurde durch NIH-Zuschüsse an N.W.C. (T32 HL007224, T32 HL007284), S.C. (T32 HL007284), K.W. (R01 HL142650) und K.K.H. (R01 HL146056, R01 DK118728, UH3 EB025765) finanziert.
Materials
| 2 mL Eppendorf safe-lock tubes | USA Scientific | 4036-3352 | |
| 5 ml Falcon Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
| 60 mm Non TC-treated Culture Dish | Corning | 430589 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD31 | BD Biosciences | 551262 | |
| APC Rat IgG2a κ Isotype Control | BD Biosciences | 553932 | |
| BD FACSChorus Software | BD Biosciences | FACSCHORUS | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | FACSMELODY | |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | 234115 | |
| Costar 48-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, Individually Wrapped, Sterile | Corning | 3548 | |
| D-Glucose | Gibco | A2494001 | |
| Disposable Graduated Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 12-711-9AM | |
| Dissecting Pan Wax | Carolina | 629100 | |
| Dissection scissors | Fine Science Tools | 14085-08 | |
| Dissection Stereo Microscope M165 FC | Leica | M165FC | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-052 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Eppendorf Flex-Tubes Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22364120 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio | 100-106 | |
| Fine dissection forceps | Fine Science Tools | 11250-00 | |
| Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630130 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | 11695067772 | |
| Isotemp General Purpose Deluxe Water Bath | Fisher Scientific | FSGPD20 | |
| Primer: ActB_Forward: 5’- agagggaaatcgtgcgtgac -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: ActB_Reverse: 5’- caatagtgatgacctggccgt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Forward: 5’- gagcccaatcacgtttcagttt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD31_Reverse: 5’- tccttcctgcttcttgctagct -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Forward: 5’- gggttgttctgtgccttgtt -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: CD45_Reverse: 5’- ctggacggacacagttagca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Forward: 5’- tcctctgcatcctcactatcaca -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Primer: VE-Cadherin_Reverse: 5’- gtaagtgaccaactgctcgtgaat -3’ | Integrated DNA Technologies | N/A | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Centrifuge, Refrigerated | ThermoFisher | 75002477 | |
| SYBR-Green iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5120 | |
| Trypan Blue Solution | ThermoFisher | 15250061 | |
| V450 Rat Anti-Mouse CD45 | BD Biosciences | 560501 | |
| V450 Rat IgG2b, κ Isotype Control | BD Biosciences | 560457 |
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