שבב מיקרופלואידי פשוט לגדילה והדמיה ארוכת טווח של Caenorhabditis elegans
Summary
הפרוטוקול מתאר תכנון שבבים מיקרופלואידיים פשוטים ומתודולוגיית מיקרו-פבריקציה המשמשת לגידול C. elegans בנוכחות אספקת מזון רציפה למשך עד 36 שעות. מכשיר הגדילה וההדמיה מאפשר גם הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה לסירוגין של תהליכים תאיים ותת-תאיים במהלך הפיתוח במשך מספר ימים.
Abstract
Caenorhabditis elegans (C. elegans) הוכיחו את עצמם כמערכת מודל רבת ערך לחקר תהליכים התפתחותיים וביולוגיים של תאים. הבנת תהליכים ביולוגיים אלה דורשת לעתים קרובות הדמיה ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותה חיה. לזמני התאוששות ארוכים הקשורים לשיטות אימוביליזציה קונבנציונליות המבוצעות על רפידות אגר יש השפעות מזיקות על בריאות בעלי החיים, ולכן אין זה ראוי לדמות שוב ושוב את אותה חיה לאורך תקופות זמן ארוכות. מאמר זה מתאר תכנון שבב מיקרופלואידי, שיטת ייצור, פרוטוקול גידול C. elegans על השבב, ושלוש דוגמאות להדמיה ארוכת טווח לחקר תהליכים התפתחותיים בחיות בודדות. השבב, המיוצר עם פולידימתילסילוקסן ומלוכד על זכוכית כיסוי, משתק בעלי חיים על מצע זכוכית באמצעות קרום אלסטומרי המוסט באמצעות גז חנקן. אימוביליזציה מלאה של C. elegans מאפשרת הדמיה חזקה בהילוך מהיר של אירועים תאיים ותת-תאיים באופן נטול הרדמה. גיאומטריית תעלה עם חתך רוחב גדול מאפשרת לבעל החיים לנוע בחופשיות בתוך שני ממברנות בידוד אטומות חלקית המאפשרות צמיחה בתעלה עם אספקת מזון רציפה. באמצעות שבב פשוט זה, ניתן לבצע הדמיה של תופעות התפתחותיות כגון גדילת תהליכים עצביים, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירונים החושיים PVD, כאשר החיה גדלה בתוך התעלה. שבב הגידול וההדמיה לטווח ארוך פועל עם קו לחץ יחיד, ללא שסתומים חיצוניים, חומרים מתכלים נוזליים זולים, ומשתמש בפרוטוקולים סטנדרטיים לטיפול בתולעים הניתנים להתאמה בקלות על ידי מעבדות אחרות באמצעות C. elegans.
Introduction
Caenorhabditis elegans הוכיח את עצמו כאורגניזם מודל רב עוצמה לחקר ביולוגיה של התא, הזדקנות, ביולוגיה התפתחותית ונוירוביולוגיה. יתרונות כגון גופו השקוף, מחזור חיים קצר, תחזוקה קלה, מספר מוגדר של תאים, הומולוגיה עם מספר גנים אנושיים וגנטיקה שנחקרה היטב הובילו לכך ש– C. elegans הפך למודל פופולרי הן לתגליות ביולוגיות בסיסיות והן למחקר יישומי 1,2. הבנת התהליכים הביולוגיים וההתפתחותיים של התא מתצפיות ארוכות טווח חוזרות ונשנות על בעלי חיים בודדים יכולה להתברר כמועילה. באופן קונבנציונלי, C. elegans מורדם על רפידות אגר ומצולם תחת מיקרוסקופ. השפעות שליליות של חומרי הרדמה על בריאותם של בעלי חיים מגבילות את השימוש בבעלי חיים מורדמים להדמיה לסירוגין ארוכת טווח וחוזרת ונשנית של אותו בעל חיים 3,4. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות מיקרופלואידיות והתאמתן ללכידה ללא הרדמה של C. elegans עם סכנות בריאותיות זניחות מאפשרות הדמיה ברזולוציה גבוהה של אותו בעל חיים לאורך זמן קצר וארוך.
שבבים מיקרופלואידיים תוכננו עבור C. elegans’5 סינון תפוקה גבוהה 6,7,8, לכידה וחלוקה9, בדיקת סמים 10,11, גירוי נוירונים עם הדמיה ברזולוציה גבוהה 12, והדמיה ברזולוציה גבוהה שלהחיה 12,13,14. יריעות מיקרופלואידיות דקות במיוחד לאימוביליזציה בשקופיות פותחו גםהן 15. מחקרים ארוכי טווח של C. elegans בוצעו באמצעות תמונות ברזולוציה נמוכה של בעלי חיים הגדלים בתרבית נוזלית כדי לבחון גדילה, דינמיקה של סידן, השפעות סמים על התנהגותם16,17,18,19, אריכות ימיהם והזדקנותם20. מחקרים ארוכי טווח המשתמשים במיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה בוצעו כדי להעריך את ההתפתחות הסינפטית21, התחדשות עצבית22 ותוספת מיטוכונדריאלית23. הדמיה ארוכת טווח ברזולוציה גבוהה ומעקב אחר גורל התא והתמיינותו נעשו במכשירים רב-ערוציים24,25. מספר אירועים תאיים ותת-תאיים מתרחשים על פני סקאלות זמן של מספר שעות ודורשים לכידה של אותו אדם בנקודות זמן שונות במהלך התפתחותם כדי לאפיין את כל שלבי הביניים בתהליך כדי להבין את הדינמיקה התאית in vivo. כדי לדמות תהליכים ביולוגיים כמו אורגנוגנזה, התפתחות עצבית ונדידת תאים, החיה צריכה להיות משותקת באותו כיוון בכמה נקודות זמן. פרסמנו בעבר פרוטוקול להדמיה ברזולוציה גבוהה של C. elegans במשך יותר מ-36 שעות כדי לקבוע היכן מוסיפים מיטוכונדריה לאורך תאי העצב של קולטני המגע (TRNs)23.
מאמר זה מספק פרוטוקול לביסוס מתודולוגיה מבוססת מיקרופלואידיקה להדמיה חוזרת ונשנית ברזולוציה גבוהה. מכשיר זה, עם ערוץ זרימה יחיד, מתאים ביותר להדמיה חוזרת ונשנית של חיה בודדת לכל מכשיר. כדי לשפר את התפוקה ולצלם בעלי חיים רבים בו-זמנית, ניתן לחבר התקנים מרובים לאותו קו לחץ, אך עם מחברים תלת-כיווניים נפרדים השולטים על חיה אחת בכל מכשיר. העיצוב שימושי למחקרים הדורשים תמונות ברזולוציה גבוהה של קיטועי זמן כגון תהליכים התפתחותיים פוסט-עובריים, נדידת תאים, הובלת אברונים, מחקרי ביטוי גנים ועוד. הטכנולוגיה עשויה להיות מגבילה עבור יישומים מסוימים כגון מחקרי תוחלת חיים והזדקנות הדורשים גדילה והדמיה מקבילים של בעלי חיים רבים בשלב מאוחר. אלסטומר פולידימתילסילוקסן (PDMS) שימש לייצור מכשיר זה בשל יציבותו הביולוגית26, תאימות ביולוגית 27,28, חדירות גז 29,30, ומודולוס אלסטי הניתן לכוונון 31. התקן דו-שכבתי זה מאפשר צמיחה של בעלי חיים עם אספקת מזון רציפה בתעלה מיקרופלואידית ולכידה של C. elegans בודדים באמצעות דחיסת ממברנת PDMS באמצעות גז חנקן. מכשיר זה הוא הרחבה של המכשיר שפורסם בעבר עם היתרון של גידול והדמיה של אותה חיה במיקרו-ערוץ תחת אספקת מזון רציפה3. רשת ממברנות הבידוד הנוספת וממברנת לכידה ברוחב 2 מ”מ מאפשרות אימוביליזציה יעילה של בעלי חיים מתפתחים. המכשיר שימש לצפייה בהתפתחות עצבית, התפתחות הפות וארבוריזציה דנדריטית בנוירוני PVD חושיים. בעלי החיים גדלים ללא השפעות בריאותיות שליליות במכשיר וניתן לשתק אותם שוב ושוב כדי להקל על הדמיית אירועים תת-תאיים באותה חיה במהלך התפתחותה.
הפרוטוקול כולו מחולק לחמישה חלקים. חלק 1 מתאר ייצור מכשירים עבור שבב הגידול וההדמיה. חלק 2 מתאר כיצד להקים מערכת לחץ עבור סטיית ממברנת PDMS כדי לשתק ולבודד C. elegans בודדים. חלק 3 מתאר כיצד לסנכרן C. elegans על צלחת מדיום גידול נמטודה (NGM) להדמיית מכשירים. חלק 4 מתאר כיצד לטעון חיה בודדת במכשיר ולגדל את החיה בתוך המכשיר המיקרופלואידי במשך מספר ימים. חלק 5 מתאר כיצד לשתק חיה בודדת בנקודות זמן מרובות, לצלם תמונות ברזולוציה גבוהה באמצעות מטרות שונות ולנתח את התמונות באמצעות פיג’י.
Protocol
Representative Results
Discussion
במאמר זה תואר פרוטוקול לייצור ושימוש בהתקן מיקרופלואידי פשוט לגידול C. elegans עם אספקת מזון קבועה והדמיה ברזולוציה גבוהה של חיה בודדת במהלך התפתחותה. תהליך ייצור זה הוא פשוט וניתן לעשות זאת בסביבה לא סטרילית. סביבה נטולת אבק היא קריטית במהלך שלבי הייצור. נוכחותם של חלקיקי אבק תוביל למגע …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למתקן ההדמיה CIFF, NCBS על השימוש במיקרוסקופים הקונפוקליים הנתמכים על ידי שעון הקיץ – המרכז לננוטכנולוגיה (לא. SR/55/NM-36-2005). אנו מודים למימון מחקר מ- DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), דיסק מסתובב הנתמך על ידי DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK וגאוטם מנון), ומענק HHMI-IECS מספר 55007425 (SPK). זנים HB101, PS3239 ו-wdIs51 סופקו על ידי המרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). S.P.K. ייצרה את jsIs609 במעבדה של מייק נונט.
Materials
| 18 G needles | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | Gauge 18 | |
| 3-way stopcock | Cole-Parmer | WW-30600-02 | Masterflex fitting with luer lock |
| CCD camera | Andor Technology | EMCCD C9100-13no | |
| Circuit board film | Fine Line Imaging, Colorado, USA | The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI) | |
| Convection Oven | Meta-Lab Scientific Industries, India | MSI-5 | |
| Coverslips | Blue stat microscopic cover glass | 22mm x 10Gms | |
| Ethanol | Hi media | ||
| Harris uni-core puncher 1mm | Qiagen | Z708801 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 440191 | |
| Hot plate | IKA | RCT B S 22 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | 26895 | |
| KOH | Fisher Scientific | ||
| Laser Scanning Microscope | ZEISS | LSM 5 LIVE | |
| Micropipette tips | Tarsons | 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply | |
| Negative Photoresist-1 | Microchem | SU8-2025 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Negative Photoresist-2 | Microchem | SU8-2050 | http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm |
| Nitrogen gas | Local Supplier | Commercial nitrogen gas | Cylinder volume of 7 cubic meter |
| PDMS (Curing solution) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard curing solution | curing agent |
| Petri plates | Praveen Scientific Corporation | ||
| Plasma cleaner | Harrick Plasma, NY, USA | PDC-32G | |
| Razor and blades | Lister surgical Blade | ||
| Silicon Elastomer (Base) | Dow Corning Corporation, MI, USA | Sylgard 184 base | elastomer base |
| Silicon tubes | Fisher Scientific | Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm | |
| Silicon wafer | University Wafer, MA, USA | [100] orientation, 4-inch diameter | Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer |
| Spin Coater | SPS-Europe B.V., The Netherlands | SPIN 150 | |
| Spinning Disk microscope | Perkin Elmer ultra-view VOX system | CSU-X1-A3 N | The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package. |
| SU8 developer | Microchem, MA, USA | SU8 Developer | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma-Aldrich, Bangalore, India | 448931 | Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic |
| UV lamp | Oriel Instruments, Bangalore, India | 200 Watt and collimated UV light source | |
| Volocity software | Perkin-Elmer | Image analysis |
Referências
- Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
- Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
- Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
- Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
- Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
- Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
- Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
- Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
- Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
- Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
- Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
- Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
- Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
- Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
- Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
- Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
- Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
- Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
- Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
- Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
- Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
- Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
- Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
- Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
- Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
- Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
- Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
- Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
- Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
- Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
- Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
- Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Biologia do Desenvolvimento. 345 (1), 18-33 (2010).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
- Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
- Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
- Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
- Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
- Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).
