JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Een eenvoudige microfluïdische chip voor groei op lange termijn en beeldvorming van Caenorhabditis elegans

Published: April 11, 2022
doi:
10.3791/63136
, ,
1National Centre for Biological Sciences,TIFR, 2Department of Biological Sciences,TIFR, 3InSTEM, 4Manipal Academy of Higher Education, 5Department of Mechanical Engineering,The University of Texas at Austin

Summary

Het protocol beschrijft een eenvoudig microfluïdisch chipontwerp en microfabricagemethodologie die wordt gebruikt om C. elegans te laten groeien in aanwezigheid van een continue voedselvoorziening gedurende maximaal 36 uur. Het groei- en beeldvormingsapparaat maakt ook intermitterende langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie van cellulaire en subcellulaire processen mogelijk tijdens de ontwikkeling gedurende meerdere dagen.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) zijn een waardevol modelsysteem gebleken voor het bestuderen van ontwikkelings- en celbiologische processen. Het begrijpen van deze biologische processen vereist vaak langdurige en herhaalde beeldvorming van hetzelfde dier. Lange hersteltijden geassocieerd met conventionele immobilisatiemethoden op agarpads hebben schadelijke effecten op de diergezondheid, waardoor het ongepast is om hetzelfde dier gedurende lange perioden herhaaldelijk in beeld te brengen. Dit artikel beschrijft een microfluïdisch chipontwerp, fabricagemethode, on-chip C. elegans kweekprotocol en drie voorbeelden van langetermijnbeeldvorming om ontwikkelingsprocessen bij individuele dieren te bestuderen. De chip, vervaardigd met polydimethylsiloxaan en gebonden op een dekglas, immobiliseert dieren op een glazen substraat met behulp van een elastomeermembraan dat wordt afgebogen met behulp van stikstofgas. Volledige immobilisatie van C. elegans maakt robuuste time-lapse beeldvorming van cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen op een verdovingsvrije manier mogelijk. Een kanaalgeometrie met een grote doorsnede stelt het dier in staat om vrij te bewegen binnen twee gedeeltelijk afgesloten isolatiemembranen, waardoor groei in het kanaal mogelijk is met een continue voedselvoorziening. Met behulp van deze eenvoudige chip kan beeldvorming van ontwikkelingsverschijnselen zoals neuronale procesgroei, vulvalontwikkeling en dendritische arborisatie in de PVD-sensorische neuronen, terwijl het dier in het kanaal groeit, worden uitgevoerd. De langetermijngroei- en beeldvormingschip werkt met een enkele drukleiding, geen externe kleppen, goedkope vloeibare verbruiksartikelen en maakt gebruik van standaard wormbehandelingsprotocollen die gemakkelijk kunnen worden aangepast door andere laboratoria met behulp van C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans heeft bewezen een krachtig modelorganisme te zijn om celbiologie, veroudering, ontwikkelingsbiologie en neurobiologie te bestuderen. Voordelen zoals het transparante lichaam, de korte levenscyclus, eenvoudig onderhoud, een bepaald aantal cellen, homologie met verschillende menselijke genen en goed bestudeerde genetica hebben ertoe geleid dat C. elegans een populair model is geworden voor zowel fundamentele biologische ontdekkingen als toegepast onderzoek 1,2. Het begrijpen van de biologische en ontwikkelingsprocessen van cellen uit herhaalde langetermijnobservatie van individuele dieren kan nuttig blijken te zijn. Conventioneel wordt C. elegans verdoofd op agarpads en afgebeeld onder de microscoop. Schadelijke effecten van anesthetica op de gezondheid van dieren beperken het gebruik van verdoofde dieren voor langdurige en herhaalde intermitterende beeldvorming van hetzelfde dier 3,4. Recente ontwikkelingen in microfluïdische technologieën en hun aanpassing voor anesthetisch-vrije vangst van C. elegans met verwaarloosbare gezondheidsrisico’s maken beeldvorming met hoge resolutie van hetzelfde dier gedurende een korte en lange periode mogelijk.

Microfluïdische chips zijn ontworpen voor C. elegans’5 high throughput screening 6,7,8, het vangen en doserenvan 9, drug screening 10,11, neuronstimulatie met hoge resolutie imaging12 en hoge resolutie beeldvorming van het dier 12,13,14. Ultradunne microfluïdische vellen voor immobilisatie op dia’s zijn ook ontwikkeld15. Langetermijnstudies van C. elegans zijn uitgevoerd met behulp van afbeeldingen met een lage resolutie van dieren die in vloeibare cultuur groeien om groei, calciumdynamiek, medicijneffecten op hun gedrag 16,17,18,19, hun levensduur en veroudering20 te observeren. Langetermijnstudies met behulp van microscopie met hoge resolutie zijn uitgevoerd om synaptische ontwikkeling21, neuronale regeneratie22 en mitochondriale toevoeging23 te beoordelen. Langetermijnbeeldvorming met hoge resolutie en tracering van het lot en de differentiatie van cellen zijn gedaan in meerkanaalsapparaten24,25. Verschillende cellulaire en subcellulaire gebeurtenissen vinden plaats over de tijdschalen van enkele uren en vereisen het vangen van hetzelfde individu op verschillende tijdstippen tijdens hun ontwikkeling om alle tussenstappen in het proces te karakteriseren om cellulaire dynamiek in vivo te begrijpen. Om biologische processen zoals organogenese, neuronale ontwikkeling en celmigratie in beeld te brengen, moet het dier op meerdere tijdstippen in dezelfde oriëntatie worden geïmmobiliseerd. We hebben eerder een protocol gepubliceerd voor beeldvorming met hoge resolutie van C. elegans gedurende meer dan 36 uur om te bepalen waar mitochondriën worden toegevoegd langs de aanraakreceptorneuronen (TRN’s)23.

Dit artikel biedt een protocol voor het vaststellen van een op microfluïdica gebaseerde methodologie voor herhaalde beeldvorming met hoge resolutie. Dit apparaat, met een enkel stroomkanaal, is het meest geschikt voor herhaalde beeldvorming van een enkel dier per apparaat. Om de doorvoer te verbeteren en veel dieren tegelijk in beeld te brengen, kunnen meerdere apparaten op dezelfde drukleiding worden aangesloten, maar met afzonderlijke driewegconnectoren die een enkel dier in elk apparaat besturen. Het ontwerp is nuttig voor studies die time-lapse-beelden met hoge resolutie vereisen, zoals post-embryonale ontwikkelingsprocessen, celmigratie, organeltransport, genexpressiestudies, enz. De technologie kan beperkend zijn voor sommige toepassingen, zoals levensduur- en verouderingsstudies die parallelle groei en beeldvorming van veel dieren in een laat stadium vereisen. Polydimethylsiloxaan (PDMS) elastomeer werd gebruikt voor de fabricage van dit apparaat vanwege de biostabiliteit26, biocompatibiliteit 27,28, gaspermeabliliteit29,30 en instelbare elastische modulus31. Dit tweelaagse apparaat maakt de groei mogelijk van dieren met continue voedseltoevoer in een microfluïdisch kanaal en het vangen van individuele C. elegans via PDMS-membraancompressie met behulp van stikstofgas. Dit apparaat is een uitbreiding van het eerder gepubliceerde apparaat met het voordeel dat hetzelfde dier in het microkanaal wordt gekweekt en in beeld gebracht onder een continue voedselvoorziening3. Het extra isolatiemembraannetwerk en een 2 mm breed vangmembraan maken een efficiënte immobilisatie van ontwikkelende dieren mogelijk. Het apparaat is gebruikt om neuronale ontwikkeling, vulvalontwikkeling en dendritische prieelvorming in sensorische PVD-neuronen te observeren. De dieren groeien zonder nadelige gezondheidseffecten in het apparaat en kunnen herhaaldelijk worden geïmmobiliseerd om het afbeelden van subcellulaire gebeurtenissen bij hetzelfde dier tijdens de ontwikkeling te vergemakkelijken.

Het hele protocol is verdeeld in vijf delen. Deel 1 beschrijft de fabricage van apparaten voor de groei- en beeldvormingschip. Deel 2 beschrijft hoe een druksysteem moet worden opgezet voor de PDMS-membraanafbuiging om individuele C. elegans te immobiliseren en te isoleren. Deel 3 beschrijft hoe C. elegans op een nematode groeimedium (NGM) plaat te synchroniseren voor beeldvorming van apparaten. Deel 4 beschrijft hoe je een enkel dier in het apparaat laadt en het dier gedurende meerdere dagen in het microfluïdische apparaat laat groeien. Deel 5 beschrijft hoe een individueel dier op meerdere tijdstippen kan worden geïmmobiliseerd, afbeeldingen met een hoge resolutie kunnen worden vastgelegd met verschillende doelstellingen en de afbeeldingen kunnen worden geanalyseerd met Fiji.

Protocol

1. Fabricage van groei- en beeldvormingsapparatuur SU8 matrijs fabricageOntwerp patronen 1 (flow layer) en 2 (control layer) met behulp van rechthoekige vormen in een tekstverwerkingssoftware (of een computerondersteunde ontwerp CAD-software) en print de fotomaskers met behulp van een laserplotter met een minimale functiegrootte van 8 μm op polyester-gebaseerde film (figuur 1). Snijd siliconen wafels in stukken van 2,5 cm × 2,5 cm en reinig ze …

Representative Results

Apparaatkarakterisering: Het groei- en beeldvormingsapparaat bestaat uit twee PDMS-lagen die aan elkaar zijn gebonden (figuur 1) met behulp van onomkeerbare plasmabinding. De stromingslaag (patroon 1) die 10 mm lang en 40 μm of 80 μm hoog is, stelt ons in staat om het dier in vloeibare cultuur te laten groeien (figuur 1A). De vanglaag (patroon 2) heeft een membraan van 2 mm breed (figuur 1B) voor het immobilisere…

Discussion

In dit artikel is een protocol beschreven voor de fabricage en het gebruik van een eenvoudig microfluïdisch apparaat voor het kweken van C. elegans met constante voedselvoorziening en beeldvorming met hoge resolutie van een enkel dier tijdens de ontwikkeling ervan. Dit fabricageproces is eenvoudig en kan worden uitgevoerd in een niet-steriele omgeving. Een stofvrije omgeving is van cruciaal belang tijdens fabricagestappen. De aanwezigheid van stofdeeltjes zou leiden tot onjuist contact tussen de twee verlijming…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We bedanken CIFF imaging facility, NCBS voor het gebruik van de confocale microscopen ondersteund door het DST – Centre for Nanotechnology (Nr. SR/55/NM-36-2005). We bedanken onderzoeksfinanciering van DBT (SPK), CSIR-UGC (JD), DST (SM), DBT (SM), draaiende schijf ondersteund door DAE-PRISM 12-R&D-IMS-5.02.0202 (SPK en Gautam Menon) en HHMI-IECS-subsidienummer 55007425 (SPK). HB101-, PS3239– en wdIs51-stammen werden geleverd door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door het NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). S.P.K. maakte jsIs609 in het laboratorium van Mike Nonet.

Materials

18 G needles Sigma-Aldrich, Bangalore, India Gauge 18
3-way stopcock Cole-Parmer WW-30600-02 Masterflex fitting with luer lock
CCD camera Andor Technology EMCCD C9100-13no
Circuit board film Fine Line Imaging, Colorado, USA The designs are printed with 65,024 dots per inch (DPI)
Convection Oven Meta-Lab Scientific Industries, India MSI-5
Coverslips Blue stat microscopic cover glass 22mm x 10Gms
Ethanol Hi media
Harris uni-core puncher 1mm Qiagen Z708801
Hexamethyldisilazane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 440191
Hot plate  IKA RCT B S 22
Isopropanol Fisher Scientific 26895
KOH Fisher Scientific
Laser Scanning Microscope ZEISS LSM 5 LIVE
Micropipette tips Tarsons 0.5-10 µL micropipette tips are used for food supply
Negative Photoresist-1 Microchem SU8-2025 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Negative Photoresist-2 Microchem SU8-2050 http://www.microchem.com/Prod-SU82000.htm
Nitrogen gas Local Supplier Commercial nitrogen gas Cylinder volume of 7 cubic meter
PDMS (Curing solution) Dow Corning Corporation, MI, USA  Sylgard curing solution curing agent
Petri plates Praveen Scientific Corporation
Plasma cleaner Harrick Plasma, NY, USA  PDC-32G
Razor and blades Lister surgical Blade
Silicon Elastomer (Base) Dow Corning Corporation, MI, USA Sylgard 184 base elastomer base
Silicon tubes Fisher Scientific Plastic tubes with the inner diameter 1.59 mm and the outer diameter 3.18 mm
Silicon wafer University Wafer, MA, USA [100] orientation, 4-inch diameter Small pieces (2 mm × 2 mm) were cut from 100 mm diameter wafer
Spin Coater SPS-Europe B.V., The Netherlands SPIN 150
Spinning Disk microscope Perkin Elmer ultra-view VOX system CSU-X1-A3 N The system was equipped with four (405/488/561/640 nm) lasers and controlled with the Volocity software package.
SU8 developer Microchem, MA, USA SU8 Developer
Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane Sigma-Aldrich, Bangalore, India 448931 Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane vapor is toxic
UV lamp Oriel Instruments, Bangalore, India 200 Watt and collimated UV light source
Volocity software Perkin-Elmer Image analysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Doitsidou, M., Poole, R. J., Sarin, S., Bigelow, H., Hobert, O. C. elegans Mutant Identification with a One-Step Whole-Genome-Sequencing and SNP Mapping Strategy. PloS One. 5 (11), 15435 (2010).
  2. Hobert, O. Neurogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2010).
  3. Mondal, S., Ahlawat, S., Rau, K., Venkataraman, V., Koushika, S. P. Imaging in vivo neuronal transport in genetic model organisms using microfluidic devices. Traffic. 12 (4), 372-385 (2011).
  4. Steele, L. M., Sedensky, M. M. Approaches to Anesthetic Mechanisms: The C. elegans Model. Methods in Enzymology. 602, 133-151 (2018).
  5. San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. The C. elegans. Research Community, WormBook. , (2013).
  6. Cáceres, I. C., Valmas, N., Hilliard, M. A., Lu, H. Laterally orienting C. elegans using geometry at microscale for high-throughput visual screens in neurodegeneration and neuronal development studies. PloS One. 7 (4), 35037 (2012).
  7. Ai, X., Zhuo, W., Liang, Q., McGrath, P. T., Lu, H. A high-throughput device for size based separation of C. elegans developmental stages. Lab on a Chip. 14 (10), 1746-1752 (2014).
  8. Chung, K., Crane, M. M., Lu, H. Automated on-chip rapid microscopy, phenotyping and sorting of C. elegans. Nature Methods. 5 (7), 637-643 (2008).
  9. Desta, I. T., et al. Detecting and Trapping of a Single C. elegans Worm in a Microfluidic Chip for Automated Microplate Dispensing. SLAS Technology. 22 (4), 431-436 (2017).
  10. Ben-Yakar, A. High-Content and High-Throughput In Vivo Drug Screening Platforms Using Microfluidics. Assay and Drug Development Technologies. 17 (1), 8-13 (2019).
  11. Mondal, S., et al. Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model. Nature Communications. 7, 13023 (2016).
  12. Fehlauer, H., et al. Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. Elegant. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56530 (2018).
  13. Saberi-Bosari, S., Huayta, J., San-Miguel, A. A microfluidic platform for lifelong high-resolution and high throughput imaging of subtle aging phenotypes in C. elegans. Lab on a Chip. 18 (20), 3090-3100 (2018).
  14. Cornaglia, M., et al. An automated microfluidic platform for C. elegans embryo arraying, phenotyping, and long-term live imaging. Scientific Reports. 5, 10192 (2015).
  15. Suzuki, M., et al. Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration. Journal of Neuroscience Methods. 306, 32-37 (2018).
  16. Hulme, S. E., et al. Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans. Lab on a Chip. 10 (5), 589-597 (2010).
  17. Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).
  18. Lagoy, R. C., Albrecht, D. R. Microfluidic Devices for Behavioral Analysis, Microscopy, and Neuronal Imaging in Caenorhabditis Elegans. Methods in Molecular Biology. 1327, 159-179 (2015).
  19. Levine, E., Lee, K. S. Microfluidic approaches for Caenorhabditis elegans research. Animal Cells and Systems. 24 (6), 311-320 (2020).
  20. Rahman, M., et al. NemaLife chip: a micropillar-based microfluidic culture device optimized for aging studies in crawling C. elegans. Scientific Reports. 10 (1), 16190 (2020).
  21. Allen, P. B., et al. Single-synapse ablation and long-term imaging in live C. elegans. Journal of Neuroscience Methods. 173 (1), 20-26 (2008).
  22. Guo, S. X., et al. Femtosecond laser nanoaxotomy lab-on-a-chip for in vivo nerve regeneration studies. Nature Methods. 5 (6), 531-533 (2008).
  23. Mondal, S., et al. Tracking Mitochondrial Density and Positioning along a Growing Neuronal Process in Individual C. elegans Neuron Using a Long-Term Growth and Imaging Microfluidic Device. eNeuro. 8 (4), (2021).
  24. Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. Long-Term High-Resolution Imaging of Developing C. elegans Larvae with Microfluidics. Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).
  25. Gritti, N., Kienle, S., Filina, O., Van Zon, J. S. Long-term time-lapse microscopy of C. Elegans post-embryonic development. Nature Communications. 7, 12500 (2016).
  26. Kim, S., et al. A biostable, anti-fouling zwitterionic polyurethane-urea based on PDMS for use in blood-contacting medical devices. Journal of materials chemistry B. 8 (36), 8305-8314 (2020).
  27. Peterson, S. L., McDonald, A., Gourley, P. L., Sasaki, D. Y. Poly(dimethylsiloxane) thin films as biocompatible coatings for microfluidic devices: cell culture and flow studies with glial cells. Journal of Biomedical Materials ResearchPart A. 72 (1), 10-18 (2005).
  28. Folch, A., Toner, M. Cellular micropatterns on biocompatible materials. Biotechnology Progress. 14 (3), 388-392 (1998).
  29. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Microfluidic PDMS (polydimethylsiloxane) bioreactor for large-scale culture of hepatocytes. Biotechnology Progress. 20 (3), 750-755 (2004).
  30. Mehta, G., et al. Quantitative measurement and control of oxygen levels in microfluidic poly(dimethylsiloxane) bioreactors during cell culture. Biomedical Microdevices. 9 (2), 123-134 (2007).
  31. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PloS One. 7 (12), 51499 (2012).
  32. Inoue, T., et al. Gene expression markers for Caenorhabditis elegans vulval cells. Mechanisms of Development. 119, 203-209 (2002).
  33. Fatouros, C., et al. Inhibition of Tau aggregation in a novel caenorhabditis elegans model of tauopathy mitigates proteotoxicity. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3587-3603 (2012).
  34. Smith, C. J., et al. Time-lapse imaging and cell-speci fi c expression pro fi ling reveal dynamic branching and molecular determinants of a multi-dendritic nociceptor in C. elegans. Biologia do Desenvolvimento. 345 (1), 18-33 (2010).
  35. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genética. 77 (1), 71-94 (1974).
  36. Oren-Suissa, M., Hall, D. H., Treinin, M., Shemer, G., Podbilewicz, B. The fusogen EFF-I controls sculpting of mechanosensory dendrites. Science. 328 (5983), 1285-1288 (2010).
  37. Smith, C. J., et al. Sensory neuron fates are distinguished by a transcriptional switch that regulates dendrite branch stabilization. Neuron. 79 (2), 266-280 (2013).
  38. Shrestha, B. R., Grueber, W. B. Neuronal morphogenesis: worms get an EFF in dendritic arborization. Current Biology: CB. 20 (16), 673-675 (2010).
  39. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Optics Express. 16 (13), 9884-9894 (2008).
  40. Sure, G. R., et al. UNC-16/JIP3 and UNC-76/FEZ1 limit the density of mitochondria in C. elegans neurons by maintaining the balance of anterograde and retrograde mitochondrial transport. Scientific Reports. 8 (1), 8938 (2018).
  41. Awasthi, A., et al. Regulated distribution of mitochondria in touch receptor neurons of C. elegans influences touch response. bioRxiv. , (2020).

Tags

Microfluidic ChipCaenorhabditis ElegansDevice FabricationFlow LayerControl LayerPhotoresistSpin CoatingUV ExposureSoft BakeDevice ReusabilityImagingLong-term Growth
check_url/pt/63136?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Dubey, J., Mondal, S., Koushika, S. P. A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (182), e63136, doi:10.3791/63136 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image